E. coli 발현 시스템에서 단백질 포집체를 극복하는 핵심 전략
E. coli 발현 시스템은 잘 확립된 대사 경로, 빠른 세포 성장, 높은 단백질 발현 수준 및 명확한 유전적 배경으로 인해 재조합 단백질 생산의 핵심 요소로 여겨집니다. 이러한 장점에도 불구하고 이 시스템을 사용할 때 주요 도전 과제는 단백질이 포집체 (inclusion bodies) 로 응집되는 경향입니다. 이러한 불용성 응집체는 종종 생물학적 활성을 갖지 못하여 기능적인 단백질을 확보하려는 연구자들에게 상당한 장애물이 됩니다. 여기서는 E. coli 내 재조합 단백질의 용해도를 향상시키고 포집체 형성을 완화하기 위한 다섯 가지 필수 전략을 제시합니다.
1. 신호 펩타이드 제거
신호 펩타이드는 일반적으로 5-30 개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 새로 합성된 단백질이 분비 경로를 따라 이동하도록 안내하고 특정한 3 차원 구조로 접히도록 돕습니다. 또한 신호 펩타이드는 단백질의 최종 위치를 특정 세포 내 구획으로 결정합니다. E. coli 의 세포 내 단백질 발현 맥락에서 신호 펩타이드는 종종 기능적으로 중복되며 심지어 해롭기도 합니다. 신호 펩타이드의 소수성 (hydrophobic) 성질은 단백질 응집 및 포집체 형성을 유도할 수 있습니다. 따라서 목표 단백질 서열로부터 신호 펩타이드를 제거하는 것이 E. coli 에서 용해성 발현을 촉진하기 위해 권장됩니다 (Baneyx, 1999).
2. 코돈 최적화 (Codon Optimization)
단백질 합성 과정에서 해당 코돈을 가진 tRNA 는 아미노산을 mRNA 로 안내하여 번역을 수행합니다. 원핵생물 시스템에서는 tRNA 의 차별적 풍부함으로 인해 코돈 편향 (codon bias) 이 발생합니다. E. coli 는 AGA, AGG, CGG, CGA, AUA, CUA, GGA, CCC 등 8 개의 희귀 코돈을 포함합니다. 관심 유전자가 야생형 (wild-type) 이라면 희귀 코дон 빈도를 먼저 분석하는 것이 좋습니다. 희귀 코돈 빈도가 낮은 유전자의 경우 Rosetta 균주를 사용하여 발현을 향상시킬 수 있습니다. 하지만 유전자에 고빈도의 희귀 코돈이 포함되어 있는 경우, 코돈 최적화 후 유전자 합식이 가장 좋은 접근법입니다. 코돈 최적화는 E. coli 에서 더 자주 사용되는 코돈 (일반적으로 사용 빈도 >20%) 을 선택하는 것을 포함합니다. 이 과정은 mRNA 2 차 구조의 안정성을 향상시키고, tRNA 풀이 부족하게 되어 발생하는 번역 지연, 조기 종결, 프레임 시프트 및 아미노산 불일치를 예방할 수 있습니다 (Gustafsson et al., 2004).
3. 적절한 발현 벡터 선택
최적화된 유전자 서열로도 용해성 단백질 발현을 달성하려면 올바른 발현 벡터를 선택해야 합니다. pET28 시리즈는 다양한 단백질에 널리 적용됩니다. pET22b 벡터는 목표 단백질을 외막 공간 (periplasmic space) 으로 분비하도록 안내하여 이황화 결합 형성과 적절한 단백질 접힘을 촉진함으로써 용해도를 향상시킵니다. pGEX4T, pET32, pET43.1 과 같은 융합 시스템은 용해를 촉진하는 융합 태그를 포함함으로써 용해도 향상을 도모할 수도 있습니다. 또한 pCold 와 pBAD 시리즈 벡터는 단백질 발현 조건 최적화에 탁월한 선택지입니다 (Rosano and Ceccarelli, 2014).
4. 적합한 발현 균주 선택
적절한 발현 벡터를 선택한 후, 다음 단계는 단백질 발현을 위한 올바른 E. coli 균주를 선택하는 것입니다. BL21 균주는 일상적인 단백질 발현에 널리 사용됩니다. T7E 균주는 단백질 발현 수준을 향상시킬 수 있습니다. Origami 균주는 세포질 내 이황화 결합 형성을 촉진하도록 설계되었습니다. Arctic 균주는 12°C 에서 유도를 허용하여 단백질 용해도와 활성을 개선할 수 있습니다 (Takai et al., 2001).
5. 발현 조건 최적화
용해성 단백질 발현 달성은 발현 시스템의 모든 측면을 고려하는 종합적인 접근이 필요합니다. 이는 다양한 E. coli 균주와 발현 벡터의 호환성을 테스트하고 유도 조건 (적절한 배양 medium, 유도 온도 조절, 유도제 농도 세밀 조정 등) 을 최적화하는 것을 포함합니다. 이러한 최적화는 포집체 형성을 현저히 줄일 수 있습니다 (Baneyx and Mujacic, 2004).
결론
E. coli 단백질 발현에서 포집체 형성은 흔한 도전 과제이지만 항상 불리움만은 아닙니다. 포집체는 종종 높은 단백질 발현 수준을 제공하고 정제가 더 쉬워 웨스턴 블롯팅용 항체 생산 등 특정 응용에는 적합한 선택지가 될 수 있습니다. 그러나 생물학적 활성 단백질을 얻기 위해서는 위에서 설명한 전략들 (신호 펩타이드 제거, 코돈 최적화, 적절한 벡터 및 균주 선택, 발현 조건 최적화) 을 신중하게 고려함으로써 포집체로 인한 도전 과제를 효과적으로 극복하고 E. coli 시스템에서 성공적인 단백질 발현을 달성할 수 있습니다.
참고문헌
1. Baneyx, F. (1999). Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology, 10(5), 411-421.
2. Baneyx, F., & Mujacic, M. (2004). Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nature Biotechnology, 22(11), 1399-1408.
3. Gustafsson, C., Govindarajan, S., & Minshull, J. (2004). Codon bias and heterologous protein expression. Trends in Biotechnology, 22(7), 346-353.
4. Rosano, G. L., & Ceccarelli, E. A. (2014). Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology, 5, 172.
5. Takai, K., Nakajima, R., & Tanokura, M. (2001). Expression of soluble and functional human liver fatty acid-binding protein in Escherichia coli using the cold-shock expression system. Protein Expression and Purification, 22(2), 245-251.
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Dylan Z Dylan Z 는 EnkiLife 의 단백질 및 항체 전문가로, 단백질 발현 시스템과 항체 준비 기술에精通합니다. 그는 기술의 우수성을 지향하며 사용자에게 안정적이고 사용하기 쉬운 제품을 개발하는 데 헌신하고 있습니다. |