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웨스턴 블롯의 일반적인 시약 배합

일반 웨스턴 블롯 시약 조리법

일반 웨스턴 블롯 시약 조리법

시약 준비를 위한 전문 가이드


 용해 완충액             완충액 제조법             전기영동             전이             블로킹 용액

일반적인 용해 완충액 조리법

세포골격 결합 단백질 추출 완충액

세포골격 결합 단백질을 위한 추출 용액

Tris, pH 7.4                        10 mM
NaCl                        100 mM
EDTA                        1 mM
EGTA                        1 mM
NaF                        1 mM
Na₄P₂O₇                        20 mM
Na₃VO₄                        2 mM
Triton X-100                        1%
Glycerol                        10%
SDS                        0.1%
Sodium deoxycholate                        0.5%

용해성 단백질 완충액

용해성 단백질을 위한 추출 용액

Tris-HCl, pH 7.5                        20 mM
EGTA (Ca²⁺ chelator)                        1 mM

RIPA 용해 완충액

핵막 파괴 및 핵 단백질 추출에 적합

Tris HCl, pH 8                        50 mM
NaCl                        150 mM
NP-40                        1%
Sodium deoxycholate                        0.5%
SDS                        0.1%
이온성 계면활성제 sodium deoxycholate 를 포함하며, 핵막 파괴 및 핵 단백질 추출에 적합합니다. 키나아제를 변성시키고 단백질 상호작용을 방해할 수 있습니다.

NP-40 용해 완충액

부드러운 용해 완충액 조리법

Tris HCl, pH 8                        20 mM
NaCl                        137 mM
Glycerol                        10%
NP-40                        1%
EDTA                        2 mM

일반적인 시약 제조법

100 mM EDTA 스톡 용액

EDTA 용액 제조법

EDTA                        1.86g
Ultrapure water                        40ml
NaOH                        pH 7.4 로 조정
Bring to volume                        50ml
Storage condition                        4℃

10×TBS 농축액

TBS 완충액 농축물

Trizma HCl                        24.23 g
NaCl                        80.06 g
pH adjustment                        7.6 (HCl)
Bring to volume                        1L ddH₂O

TBST 작업용 용액 (1L)

세척 완충액

10×TBS                        100 ml
Ultrapure water                        900 ml
Tween20                        1 ml

인산가수분해효소 억제제 스톡 용액

단백질 탈인산화 방지

Sodium orthovanadate                        100mM
Solvent                        Double distilled water
pH adjustment                        9.0 (HCl)
Treatment                        끓이기直到无色 (색이 사라질 때까지)
Storage condition                        -20℃
환풍橱 (fume hood) 에서 작업하며, 끓일 때 증발 방지를 위해 덮개를 씌우고, 용액이 노란색으로 변하면 폐기합니다. 일반적인 작업 농도 범위는 1-10 mM 입니다.

부드러운 탈리 완충액 (1L)

막 재생성 완충액

Glycine                        15 g
SDS                        1 g
Tween20                        10 ml
pH                        2.2
Solvent                        Ultrapure water to 1L

강한 탈리 완충액 (100ml)

강한 막 재생성 완충액

10% SDS                        20 ml
0.5M Tris HCl pH 6.8                        12.5 ml
Ultrapure water                        67.5 ml
β-mercaptoethanol                        0.8 ml
환풍橱 (fume hood) 에서 작업합니다

항체 희석 완충액

1 차 또는 2 차 항체를 위한 희석 용액

Normal serum                        100 µl
BSA                        10 mg
TBS                        900 µl

탄산염 코팅 완충액 (100mM, pH 9.6)

ELISA 실험을 위한 코팅 완충액

Na₂CO₃                        3.03 g
NaHCO₃                        6.0 g
Solvent                        Ultrapure water to 1L

PBS (pH 7.4, 500ml)

인산완충 생리식염수

Na₂HPO₄                        1.16 g
KCl                        0.1 g
KH₂PO₄                        0.1 g
NaCl                        4 g

1 M Tris-HCl, pH 7.6

Tris 완충액

Tris base                        12.11 g
ddH2O                        80 mL
pH adjustment                        7.6 (HCl)
Bring to volume                        100mL ddH2O

0.5 M Tris-HCl, pH 6.8

Tris 완충액

Tris base                        6.06 g
ddH2O                        60 mL
pH adjustment                        6.8 (HCl)
Bring to volume                        100mL ddH2O

10% SDS

SDS 용액

SDS                        1g
ddH2O                        10mL

1.0% Bromophenol Blue

전기영동 지표제

Bromophenol Blue                        100mg
ddH2O                        10mL

전기영동 관련 시약

SDS 로딩 완충액 (2X)

SDS-PAGE 로딩용

0.5 M Tris-HCl, pH 6.8                        2.5ml
Glycerol                        2ml
10%SDS                        4ml
0.1% Bromophenol Blue                        0.5ml
ddH2O                        to 10mL

LDS 로딩 완충액 (4X)

LDS-PAGE 로딩용

Tris HCl                        0.666g
Tris base                        0.682g
LDS                        0.8g
EDTA                        0.006g
Glycerol                        4g
SERVA Blue G250 (1% solution)                        0.75ml
Phenol red (1% solution)                        0.25ml
ddH2O                        to 10ml

Tris-Glycine SDS 전기영동 완충액 (10X)

SDS-PAGE 전기영동 완충액

Tris base                        29g
Glycine                        144g
SDS                        10g
ddH2O                        to 1000ml

Tris-Glycine Native 전기영동 완충액 (10X)

Native PAGE 전기영동 완충액

Tris base                        29g
Glycine                        144g
ddH2O                        to 1000ml

MOPS SDS 전기영동 완충액 (20X)

MOPS 완충액 시스템 전기영동 완충액

MOPS                        104.6g
Tris base                        60.6g
SDS                        10g
EDTA                        3g
ddH2O                        to 500ml

MES SDS 전기영동 완충액 (20X)

MES 완충액 시스템 전기영동 완충액

MES                        97.6g
Tris base                        60.6g
SDS                        10g
EDTA                        3g
ddH2O                        to 500ml

Tricine SDS 전기영동 완충액 (10X)

Tricine 완충액 시스템 전기영동 완충액

Tricine                        179g
Tris base                        121g
SDS                        10g
ddH2O                        to 1000ml

전이 관련 완충액

Tris-Glycine 전이 완충액 (25X)

웨스턴 전이 완충액

Tris base                        18.2g
Glycine                        90g
ddH2O                        to 500ml

Bis-Tis 전이 완충액 (20X)

Bis-Tris 시스템 전이 완충액

Bicine                        10.2g
Bis-Tris (free base)                        13.1g
EDTA                        0.75g
ddH2O                        to 125ml

블로킹 완충액 및 겔 조리법

5% 탈지유 블로킹 완충액

웨스턴 블롯 블로킹 완충액

Skim milk powder                        2.5g
TBST or PBST                        to 50ml

3% BSA 블로킹 완충액

웨스턴 블롯 블로킹 완충액

BSA                        1.5g
TBST or PBST                        to 50ml

분리 겔 조리법

SDS-PAGE 분리 겔

Solution                        6%/10%/12%/16%/20%
50% Acrylamide/Bis                        3/5/6/8/10 ml
분리 겔 완충액                        9.4 ml
10%SDS                        250 ul
50% Sucrose                        4 ml
ddH2O                        7.8/5.8/4.8/2.7/0.75 ml
TEMED                        6.25 ul
APS                        625 ul
TEMED 와 APS 를 마지막에 추가하며, 겔 주입 전 충분히 혼합합니다.

50% Acrylamide/Bis

겔 스톡 용액

Acrylamide                        48.3g
Bis                        1.7g
ddH2O                        to 100ml

분리 겔 완충액

분리 겔 완충액

Tris                        30.3g
HCl                        pH 8.8 로 조정
ddH2O                        to 250ml

50% Sucrose

설탕 용액

Sucrose                        50g
ddH2O                        to 100ml

암모늄 과황산 (APS) (신선하게 준비)

겔 중합 개시제

Ammonium persulfate                        100mg
ddH2O                        to 2ml

4% 스택 겔

SDS-PAGE 스택 겔

50% Acrylamide/Bis                        1ml
스택 겔 완충액                        4.2ml
10%SDS                        125ul
ddH2O                        6.3ml
TEMED                        5ul
APS                        1ml
TEMED 와 APS 를 마지막에 추가하며, 겔 주입 전 충분히 혼합합니다.

스택 겔 완충액

스택 겔 완충액

Tris                        11.4g
HCl                        pH 6.8 로 조정
ddH2O                        to 250ml

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