냉동 시료 면역조직화학 (IHC) 검출 프로토콜
1. 조직 OCT 박제
목적: 조직 샘플에 OCT 화합물을 박제하고 동결하여 후속 절단 및 고정.
재료:
- 조직 샘플
- 이소펜테인 (Isopentane)
- ドライ아이스 (Dry ice)
- OCT 화합물
- 박제용 몰드
절차:
금속 용기를 준비하고 이소펜테인으로 부분 채워 건조얼음 위에 놓은 후 5 분 동안 냉각합니다.
신선한 조직을 박제용 몰드에 넣고 조직의 방향을 고려하여 OCT 화합물로 채웁니다.
몰드를 냉각된 이소펜테인 용기 위에 위치시켜 10-20 초 동안 유지합니다. 이소펜테인과 OCT 간의 직접 접촉을 피합니다.
동결된 조직 블록을 -80°C 동결고장기에 보관하거나 단기 보관용 -20°C에 보관합니다.
2. 절단
목적: 박제된 조직을 얇은 세그먼트로 잘라 슬라이드에 장착합니다.
재료:
- OCT 박제된 조직 샘플
- 현미경 슬라이드
- Cryostat 및 칼날
절차:
OCT 박제된 조직을 -20°C Cryostat 챔버에 넣고 30 분 ~ 1 시간 동안 온도 균형을 맞춥니다. 대형 또는 특수한 조직 타입의 경우 필요시 2 시간까지 연장합니다.
동결된 조직 블록을 시편 홀더에 고정합니다.
Cryostat 칼날을 조정하고 적절한 고정 및 절단 각도를 설정합니다.
조직 블록을 잘라 조직 표면을 노출시킵니다. 일반적으로 10-30μm 두께로 절단합니다.
5-20μm 두께로 세그먼트를 절단합니다 (실험에 따라 조정), 초기 문제 가능성이 있는 세그먼트는 버립니다.
브러시로 슬라이드에 세그먼트를 이송하고 후속 고정 단계를 준비합니다.
3. 고정
목적: 고정 처리를 통해 조직의 형태학을 보존합니다.
재료:
- 조직 세그먼트
- Buffer (PBS)
- 고정제 (10% 중성 완충 포름알데히드, 4% 파라포름알데히드, 100% 아세톤 또는 메탄올)
절차:
신선하게 잘라낸 동결 세그먼트를 실온에 15 분 동안 방치합니다.
검출 대상에 따라 적절한 고정제를 선택합니다:
저분자량 단백질, 펩타이드 및 효소용: 10% 중성 완충 포름알데히드 또는 4% 파라포름알데히드
고분자량 단백질 항원용: 100% 아세톤 또는 메탄올
고분자량 단백질 항원용: 100% 아세톤 또는 메탄올
조직 세그먼트를 고정제에 담근 후 실온에서 15 분 동안 인큐베이션합니다.
PBS 로 세그먼트를 세 번 씻습니다. 각 회당 3 분씩입니다.
4. 블로킹
목적: 배경 염색을 줄이기 위한 블로킹 단계를 수행합니다.
재료:
- 조직 세그먼트
- 블록킹 솔루션 (예: 2-10% 정상 혈청)
- 세척 버퍼 (PBS)
절차:
슬라이드를 PBS 로 세 번 씻습니다. 각 회당 3 분씩입니다.
내인성 퍼옥시다아제 활성을 억제하기 위해 3% 수소과산화물과 함께 10 분 동안 인큐베이션한 후 PBS 로 씻습니다.
단백질 블로킹을 수행하기 위해 정상 혈청 블록킹 솔루션과 함께 30 분 동안 인큐베이션합니다.
5. 항체 인큐베이션
목적: 직접 결합된 1 차 항체 또는 간접 2 차 항체 검출을 사용하여 조직을 염색합니다.
재료:
- 항체 희석 버퍼
- 세척 버퍼 (PBS)
- 결합된 1 차 항체
절차:
제조사 지침에 따라 최적의 항체 희석을 결정하고 항체 희석 버퍼로 희석합니다.
희석된 1 차 항체를 조직에 적용하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하거나 4°C 에서 밤새 인큐베이션합니다.
PBS 로 세그먼트를 세 번 씻습니다. 각 회당 3 분씩입니다.
6. 크로메노겐 반응 및 현미경
목적: 크로메노겐 반응을 통해 염색 결과를 시각화합니다.
재료:
- 크로메노겐 서브스트레이트 (예: DAB, AEC)
- 카운터스테인 (선택 사항, 예: 헤마토кси린)
- 마운팅 매체 (선택 사항, 예: 수용성 마운팅 매체)
- 커버글라스
- 현미경
절차:
준비된 크로메노겐 솔루션을 조직 세그먼트에 적용하고 현미경 아래에서 원하는 양성 신호가 나타나도록 모니터링합니다.
PBS 로 세그먼트를 세 번 씻습니다. 각 회당 3 분씩입니다.
카운터스테인 솔루션을 세그먼트에 적용하고 실온에서 2-5 분 동안 인큐베이션합니다.
슬라이드를 PBS 로 헹궈 초과 염색과 파란 헤마토кси린을 제거합니다.
소량의 마운팅 매체를 슬라이드에 적용합니다.
핀셋으로 세그먼트 위에 커버글라스를 조심스럽게 배치하고 공기 기포를 피합니다.
현미경 아래에서 세그먼트를 관찰하거나 즉시 관찰하지 않을 경우 4°C 에서 보관합니다.
| Jeff Jeff 는 EnkiLife 의 병리학 제품 전문가로, 면역조직화학 연구 및 제품 개발 분야에서 12 년 넘게 전문성을 가지고 있습니다. 그는 사용자 요구 사항에 대한 깊은 통찰력을 가지고 있으며 과학적 발견을 가속화하고 클라이언트들이 면역조직화학 실험을 수행할 수 있도록 돕고자 합니다. |
