ELISA 문제 해결 가이드
문제: 높은 배경 신호 (High Background)
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 세척 부족 | 세척 횟수를 늘리세요; 세척 사이사이에 30 초 담금 시간 추가 |
문제: 신호가 예상되지만 신호가 없음
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 시약 순서错误或 준비 불충분 | 재검사를 수행하세요; 계산법을 확인하고 새로운 버퍼, 표준 물질 등을 만드세요. 프로토콜을 검토하세요 |
| HRP 는 오염됨 | 신선한 시약 사용 |
| 항체 양이 부족함 | 농도를 증가시키세요 |
| 표준 물질이 변질됨 (샘플 웰에 신호가 있는 경우) | 표준 물질이 방향에 따라 처리되었는지 확인하세요. 새 시사용기 사용. |
| FCS 를 함유한 버퍼를 항체를 재구성하는 데 사용 | 선택된 시약을 재검증하세요 (Requalify) |
| 캡처 항체가 플레이트에 결합하지 못함 | ELISA 플레이트 사용 (조직 배양 플레이트 아님) PBS 에 추가 단백질 없이 희석 |
| 오염된 버퍼 | 신선한 버퍼 제조 |
문제: 너무 많은 신호 - 전체 플레이트가 균일하게 파랗게 됨
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 세척 부족/세척 단계 누락 - 결합되지 않은 퍼옥시다제 잔류 | 단계 사이에 철저한 세척을 보장하세요. |
| 서브스트레이트 용액을 너무 일찍 혼합하여 파랗게 됨 | 서브스트레이트 용액은 즉시 혼합하고 사용해야 함 |
| 너무 많은 스트렙타비딘-HRP | 희석량을 확인하세요, 필요한 경우 적정화 (titrate) 하세요 |
| 플레이트 밀봉재 또는 시약 저장소 재사용으로 HRP 잔류 발생. 이는 TMB 를 비특이적으로 파랗게 만듦 | 각 단계마다 신선한 플레이트 밀봉재와 시약 저장소를 사용하세요 |
| 버퍼에 금속이나 HRP 가 오염됨 | 신선한 버퍼 제조 |
문제: 표준 곡선은 달성되었으나 점들 간 판별이 불량함 (낮거나 평평한 곡선)
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 스트렙타비딘-HRP 양이 부족함 | 희석량을 확인하세요, 필요한 경우 적정화 (titrate) 하세요 |
| 캡처 항체가 플레이트에 잘 결합하지 못함 | ELISA 플레이트 사용 (조직 배양 플레이트 아님) PBS 에 추가 단백질 없이 희석 |
| 검출 항체 양이 부족함 | 희석량을 확인하세요, 필요한 경우 적정화 (titrate) 하세요 |
| 플레이트 발육 시간이 충분하지 않음 | 서브스트레이트 용액 인큐베이션 시간 증가 권장 브랜드의 서브스트레이트 용액을 사용하세요 |
| 잘못된 절차 | 일반 ELISA 프로토콜로 돌아가세요; 수정 사항이 있다면 제거 |
| 표준 곡선 희석량 계산 불충분 | 계산을 확인하고 새로운 표준 곡선을 만드세요 |
문제: 중복 검사 결과 불량 (Poor Duplicates)
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 세척 부족 | 자동 플레이트 세척기를 사용할 경우 모든 포트가 깨끗하고 장애물이 없는지 확인하세요, 30 초 담금 시간을 추가하고 세척 중간에 플레이트를 회전시키세요 |
| 절차적 오류나 낮은 플레이트 품질로 인한 불균일한 코팅 (불균일하게 결합될 수 있음) | PBS 에 추가 단백질 없이 희석 코팅 및 블로킹 부피, 시간과 시약 추가 방법을 확인하세요. 사용한 플레이트를 확인하세요 ELISA 플레이트 사용 (조직 배양 플레이트 아님) |
| 플레이트 밀봉재 재사용 | 각 단계마다 신선한 플레이트 밀봉재를 사용하세요 |
| 플레이트 밀봉재 사용 안함 | 플레이트 밀봉재 사용 |
| 버퍼 오염 | 신선한 버퍼 제조 |
문제: 검사 간 재현성 불량 (Poor assay to assay reproducibility)
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 세척 부족 | 자동 플레이트 세척기를 사용할 경우 모든 포트가 깨끗하고 장애물이 없는지 확인하세요 |
| 인큐베이션 온도 변화 | 권장 인큐베이션 온도에 따라 따르세요 환경 조건이 다른 지역에서 플레이트를 인큐베이션하지 마세요 |
| 프로토콜 변화 | 실행마다 동일한 프로토콜을 준수하세요 |
| 플레이트 밀봉재 재사용으로 HRP 잔류 발생, 이는 TMB 를 파랗게 만듦 | 각 단계마다 신선한 플레이트 밀봉재를 사용하세요 |
| 표준 곡선 희석량 계산 불충분 | 계산을 확인하고 새로운 표준 곡선을 만드세요 내부 대조군 (Internal controls) 사용 |
| 버퍼 오염 | 신선한 버퍼 제조 |
문제: 신호가 예상되지만 신호가 없음, 그러나 표준 곡선은 괜찮음
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 샘플에 사이토카인 없음 | 내부 대조군 사용 실험을 반복하고 실험 변수를 재고려하세요 |
| 샘플 매트릭스가 검출을 방해함 | 적합한 희석액에 최소 1:2 이상으로 샘플을 희석하거나, 바람직한 것은 회복률을 확인하기 위해 일련의 희석을 수행하세요 |
문제: 샘플이 너무 높은 값을 읽지만 표준 곡선은 괜찮음
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 샘플에 사이토카인 농도가 검사 범위보다 높음 | 샘플을 희석하고 다시 실행하세요 |
문제: 플레이트 전체에서 매우 낮은 판독값
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 잘못된 파장 | 필터/리더 확인 |
| 충분하지 않은 발육 시간 | 발육 시간을 늘리세요 |
| 코팅된 플레이트가 오래되어 변질됨 | 새 플레이트 코팅 |
| 캡처 항체가 플레이트에 결합하지 못함 | ELISA 플레이트 사용 (조직 배양 플레이트 아님) PBS 에 추가 단백질 없이 희석 |
| FCS 를 함유한 버퍼를 항체를 재구성하는 데 사용 | 선택된 시약을 재검증하세요 |
문제: 스트렙타비딘-HRP 를 사용할 때 정지 용액 추가 후 녹색이 발생
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 웰에서 시약이 충분히 혼합되지 않음 | 플레이트를 탭하세요 (Tap plate) |
문제: 엣지 효과 (Edge Effects)
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 작업 표면 주위의 온도 불균일 | 환경 조건이 다른 지역에서 플레이트를 인큐베이션하지 마세요 |
| 플레이트 밀봉재 사용 |
문제: 드리프트 (Drift)
| 가능 원인 | 검사 또는 조치 |
|---|---|
| 중단된 검사 세팅 | 검사 세팅은 연속적이어야 함 - 모든 표준 물질과 샘플을 적절히 준비하여 검사 시작 전에 완료하세요 |
| 시약이 실온에 있지 않음 | 피펫으로 웰에 넣기 전까지 모든 시약을 실온에 있게 하세요 (항체 삽입물에 달리 명시된 경우 제외) |