TSA Multiplex Immunofluorescence 실험에 대한 자주 묻는 질문
1. 얼어있는 부유 절편 (Frozen floating sections) 을 TSA 실험에 사용할 수 있나요?
TSA 키트는 부유 절편에 적합하지 않습니다. 부유 절편은 너무 두꺼워 시약 침투를 방해하기 때문입니다. 부유 절편은 염색 과정에서 뒤틀리거나 주름이 생길 수 있습니다.
2. 파라핀 절편용 mIHC 를 위해 항체를 어떻게 선택해야 하나요?
단클로날 항체 사용을 시도해 보세요. 항체 적용은 IHC/mIHC/IHC-P 이어야 합니다. knockout 실험으로 검증된 항체를 우선적으로 선택하세요.
3. 비특이적 결합이 발생하는 이유는 무엇인가요?
①폴클로날 항체를 사용하면 비특이적 결합이 발생할 가능성이 높습니다. 이를 개선하기 위해 단클로날 항체로 변경하거나 농도를 낮추거나, 복구 강도를 줄일 수 있습니다.
②신호 증폭이 너무 강합니다. 염색 용액 반응 시간이나 농도를 줄이세요.
③1 차 항체 농도가 너무 높거나 항원 복구가 과도합니다. 낮은 항체 희석 비율을 사용하거나 항원 복구 강도를 줄이세요.
4. 절편 분리 (Section detachment) 를 어떻게 피할 수 있나요?
①슬라이드 접착 방지 처리를 하지 않았습니다. 접착 방지용 슬라이드를 사용하거나 슬라이드에 접착 방지 처리를 하세요.
②조직 고정 불완전 또는 탈수 부족합니다. 고정 및 탈수 시간을 연장하는 등의 샘플 전처리 방법을 재최적화하세요.
③과도한 열 항원 복구 처리입니다. 온화한 조건으로 마이크로웨이브 복구를 사용하거나, 복구 온도를 약 80°C 이하로 제어하고, 2× 시트르 완충액 (pH 6.0) 을 복구 용액으로 사용하세요.
④세척 완충액 온도가 너무 높습니다. 세척 완충액 온도를 낮추거나 인큐베이션 시간을 단축하세요.
5. 색상 교차 (Color crosstalk) 가 발생하는 이유는 무엇인가요?
①이미징 장치의 필터 대역폭과 관련이 있을 수 있습니다. 좁은 파장 대역폭을 가진 필터를 사용하는 것을 시도해 보세요.
②이전 라운드의 항체 불완전한 세척과 관련이 있을 수 있습니다. CK 와 같이 높은 친화도를 가진 항체의 경우, 항체 세척 조건을 연장해야 합니다 (세척 온도와 시간 증가 등).
③신호 불균형과 관련이 있을 수 있습니다. 예를 들어, 인접한 채널 염색 중 하나가 너무 높은 강도이고 다른 하나는 너무 낮은 강도를 가져 강한 신호가 넘칠 수 있습니다.
④기타 가능한 원인, 예를 들어 항체 혼동 또는 다음 라운드에서 세척/복구 잊음 등.
6. 쥐 샘플의 경우, 쥐 기원 1 차 항체를 사용할 수 있나요?
일반적으로 권장되지 않습니다. 1 차 항체가 쥐에서 유래하면 2 차 항체도 anti-mouse 이어야 하는데, 이는 샘플 내 내인성 IgG 와 교차 반응하여 비특이적 결합을 초래할 수 있습니다.
같은 종의 샘플에서 유래한 1 차 항체를 사용해야 할 경우, 부정제 (Negative control) 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 즉, 1 차 항체 없이 2 차 항체만 추가하여 비특이적 신호가 발생할지 확인하세요.
같은 종의 샘플에서 유래한 1 차 항체를 사용해야 할 경우, 부정제 (Negative control) 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 즉, 1 차 항체 없이 2 차 항체만 추가하여 비특이적 신호가 발생할지 확인하세요.
7. 다중 표지 염색 시 마커/항체 순서를 어떻게 선택해야 하나요?
세척하기 어려운 항체는 마지막 라운드에 배치해야 합니다. 그렇지 않으면 색상 교차가 발생할 가능성이 높습니다. 쥐와 토끼 1 차 항체를 번갈아 사용하세요. 염색이 더 어려운 마커는 초기 몇 단계에 배치하세요. 저발현 표적의 경우 높은 형광 강도와 강한 반형광 (anti-quenching) 성질을 가진 염색을 선택하고 초기 단계에 배치하세요. 고발현 표적의 경우 신호 포화 및 세부 사항 가리는 것을 피하기 위해 중간 형광 강도를 가진 염색을 선택하세요. 두 단백질이 공발현되는 경우 파장 차이가 큰 염색을 사용하는 것이 좋습니다.
8. 전통적 형광 염색을 TSA Multiplex Immunofluorescence 와 결합할 수 있나요?
네, 하지만 전통적 형광 염색을 마지막 라운드에 배치하는 것이 좋습니다. 이는 TSA 방법의 항체 세척 과정에서 1 차 및 2 차 항체 결합체가 동시에 세척되기 때문입니다.
9. 뼈 조직 염색에서 높은 배경 (High background) 이 발생하는 이유는 무엇인가요?
①부족하거나 과도한 고정. 불충분한 고정은 항원 확산을 유발하고, 과도한 고정은 비특이적 결합을 초래할 수 있습니다. 해결책: 고정 시간 최적화 (보통 4% 파라포말데하이드로 24 시간 이내), 항원을 파괴하는 산성 탈석회 용액 피하기.
②강산성 탈석회 용액 (예: 염산, 질산) 은 항원 에피토프를 파괴하거나 비특이적 결합을 증가시킬 수 있습니다. 해결책: EDTA 탈석회 용액을 사용하세요.
③높은 항체 농도 dẫn다 높은 배경. 해결책: 항체 농도를 줄이세요.
④과도한 염색 발달 시간. 해결책: 먼저 5 분 동안 색을 발달시키는 것이 좋으며, 신호가 약할 경우 발달 시간을 연장할 수 있습니다.
10. 실험 조작 과정에서 광보호 (Light protection) 가 필요한가요? 염색된 슬라이드는 얼마나 저장할 수 있나요?
Enklife TSA 키트의 형광 염료는 탁월한 반형광 (anti-quenching) 성질을 가지고 있으므로, 형광 조명 아래 어둡게 조작할 필요도 없으며, 사용 중 어두운 환경에서 작업할 필요도 없습니다. 하지만 직접적인 햇빛 노출을 피하세요. 염색된 슬라이드는 일반적으로 4°C 에서 6 개월에서 12 개월까지 저장할 수 있습니다.
11. TSA Multiplex Immunofluorescence 에서 세포 크라이밍 슬라이드 (Cell climbing slides) 에 대한 주의사항
①세포 크라이밍 슬라이드는 항원 복구 처리가 필요 없습니다.
②항체 세척 완충액으로 부드럽게 항체 세척을 수행할 수 있습니다
③항체 세척 시간은 너무 길지 않아야 합니다. 그렇지 않으면 핵 염색이 불가능합니다.
④세포 크라이밍 슬라이드에 적합한 IF/ICC 항체를 선택하세요
12. TSA Multiplex Immunofluorescence 에서 얼어있는 절편 (Frozen sections) 에 대한 주의사항
①가급적 파라핀 절편을 사용하는 것이 좋습니다.
②신선 조직은 고정된 조직보다 부착이 더牢固합니다.
③얼어있는 절편 절단은 상대적으로 위험도가 높습니다. 특히 15μm 보다 두꺼운 절편의 경우.
④항체 세척 완충액으로 부드럽게 항체 세척을 수행할 수 있습니다
⑤얼어있는 절편은 3 개 이하의 마커로 제한하는 것이 좋습니다.
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