단백질 전기영동 웨스턴 블로팅 (Western Blotting) 프로토콜
웨스턴 블로팅 (immunoblotting 이라고도 함) 은 단백질 혼합물 (예: 세포 추출물) 내 개별 단백질을 분석하는 데 사용되는 기술입니다. 웨스턴 블로팅에서 단백질 혼합물은 크기, 전하 또는 개별 단백질 밴드의 기타 차이 등에 따라 정렬되도록 SDS-PAGE, native PAGE, 등전점 초점, 2 차 전기영동 등의 운반 매트릭스에 적용됩니다. 분리된 단백질 밴드는 운반 멤브레인으로 전달됩니다 (예: 질산셀룰로오스, 나일론 또는 PVDF). 이 과정을 블로팅이라고 합니다. 단백질은 전하 상호작용으로 인해 멤브레인과 같은 패턴으로 부착됩니다. 면역 블로팅에 있는 단백질은 항체 결합을 통해 검출할 수 있습니다.
키워드: 생물의학 연구, 단백질, 웨스턴 블로팅
서론
웨스턴 블로팅은 종종 연구에서 단백질을 분리하고 식별하는 데 사용됩니다. 이 기술에서는 단백질 혼합물을 분자량에 따라 분류하여 전기영동을 통해 타입별로 분리합니다. 그 결과는 멤브레인으로 전달되어 각 단백질에 대한 밴드를 생성합니다. 그런 다음 멤브레인을 관심 있는 단백질에 특이적인 표지 항체로 인큐베이션합니다.
비결합 항체는 제거되어 관심 있는 단백질에 결합된 항체만 남게 됩니다. 결합된 항체는 필름을 개발하여 검출합니다. 항체가 오직 관심 있는 단백질에만 결합하므로 오직 하나의 밴드만 관찰될 수 있습니다. 밴드의 두께는 존재하는 단백질의 양과 대응되므로, 표준품을 사용하여 존재하는 단백질의 양을 나타낼 수 있습니다. 이 논문은 먼저 웨스턴 블로팅 프로토콜을 설명하고 독자를 돕기 위한 이미지와 프로토콜을 합리화하기 위한 이론을 제시합니다. 이어지는 섹션에서는 절차에 대한 이론적 설명이 있고, 그 다음 섹션에서는 일반적인 문제点对应的 문제 해결 팁을 제공합니다.
기술
세포 용해로 단백질 추출
단백질은 조직이나 세포 등 다양한 종류의 샘플에서 추출할 수 있습니다. 아래는 부착 세포 (adherent cells) 에서 단백질을 추출하는 프로토콜입니다.
부착 세포:
냉각된 인산 완충 식염수 (PBS) 를 추가하고 부드럽게 흔들어서 조직 배양 플라스크나 디시에서 세포를 세척합니다. PBS 를 버립니다. (팁: 조직 배양 디시를 얼음 위 전체로 유지하세요).
PBS 를 추가하고 세포 스페러를 사용하여 세포를 제거합니다. 혼합물을 마이크로원심분리관으로 흡입합니다.
1500 RPM 으로 원심분리하여 5 분간 진행한 후 초상액 (supernatant) 을 버립니다.
얼음 냉각된 세포 용해 완충액을 180 μL 와 신선한 프로테아제 억제제 코크테일 20 μL 를 추가합니다. (팁: 최종 단백질 농도가 충분히 높지 않다면, 더 높은 비율의 프로테아제 억제제 코크테일로 절차를 반복하는 것이 좋습니다).
30 분 동안 얼음 위에서 인큐베이션한 후, 12,000 RPM 으로 4°C 에서 10 분간 스피닝하여 용액을 명확화합니다.
초상액 (또는 단백질 혼합물) 을 새로운 튜브로 이동시켜 얼음 위나 -20°C 또는 -80°C 에서 보관합니다.
분광광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
샘플 준비
각 웰당 50 μg 의 단백질 추출량을 결정합니다.
샘플에 5 μL 샘플 버퍼를 추가하고, 각 레인을 평준화하기 위해 이중 증류수 H2O 를 사용합니다. 잘 섞습니다. (팁: 총 부피는 레인당 15 μL 가 권장됨).
샘플을 건조 플레이트에 넣고 100°C 에서 5 분간 가열합니다.
젤 준비
10% 스택킹 젤 용액을 준비한 후 젤 고형화를 위한 랙을 조립합니다 [그림 1]. (팁: 10% AP 와 TEMED 는 용액을 고형화하므로, 언급된 시약을 마지막에 추가하지 않으면 두 겔을 동시에 준비할 수 있음).
스택킹 젤 용액을 조심스럽게 추가하여 높이가 유리 판을 고정하는 녹색 막대와 같도록 합니다 [그림 2]. 상단에 H2O 를 추가합니다. 젤이 고형화될 때까지 15–30 분간 기다립니다. (팁: 흡입 피펫트를 사용하여 겔을 유리 판에 넣는 과정을 더 쉽게 만들 수 있음).
물을 제거한 후 스택킹 젤 위에 분리 겔을 덮습니다. (팁: 장치를 기울이고 종이 타월로 물을 제거하는 것이 좋습니다).
콤비를 삽입하여 공기 거품이 없는지 확인합니다.
젤이 고형화될 때까지 기다립니다. (팁: 고형화는 튜브에 일부 겔 용액을 남겨두면 쉽게 확인할 수 있음).
그림 1.
전기영동
러닝 버퍼를 전기영동기에 부은 후 [그림 3].
겔을 전기영동기에 넣고 전원 공급 장치에 연결합니다. (팁: 전원원에 연결할 때 항상 빨간색은 빨간색, 검은색은 검은색으로 연결하세요).
버퍼가 겔을 완전히 덮도록 확인하고 콤비를 조심스럽게 제거합니다.
마커 (6 μL) 를 먼저 각 웰로 로드한 후 샘플 (15 μL) 을 로드합니다 [그림 4].
분리 겔용 저전압 (60 V) 으로 겔을 실행하고, 스택킹 젤용 고전압 (140 V) 을 사용합니다 [그림 5a 및 b].
겔을 약 1 시간 동안 실행하거나, 염색제 프론트가 겔의 바닥으로 나갔을 때까지 실행합니다 [그림 6].
전기 전달
겔의 측정값에 부합하도록 6 장의 필터 시트를 잘라내고, 동일한 치수의 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PDVF) 멤브레인을 준비합니다.
스펀지와 필터 종이를 전달 버퍼에 적시고, PDVF 멤브레인을 메탄올에 적십니다.
유리 판을 분리하여 겔을 회수합니다.
전달 샌드wich 를 다음과 같이 만듭니다:
스펀지
3 장 필터 종이
겔 PVDF
3 장 필터 종이
(팁: 겔과 PVDF 멤브레ین 사이에 공기 거품이 없는지 확인하고, 여분의 액체를 짜내세요).
샌드위치를 전달 장치로 이동시킵니다. 이 장치는 4°C 를 유지하기 위해 얼음 위에 배치해야 합니다. 전달 버퍼를 장치에 추가하고, 샌드wich 가 버퍼로 덮이도록 확인합니다. 전극을 샌드위치 상단에 배치하여 PVDF 멤브레인이 겔과 양극 사이에 위치하도록 합니다 [그림 7].
전달을 90 분 동안 수행합니다 [그림 8]. (팁: 실행 시간은 겔의 두께에 비례해야 하므로, 이는 0.75 mm 겔에서는 45 분으로 줄일 수 있음).
블로킹 및 항체 인큐베이션
멤브레인을 TBST 에 포함된 5% 우유로 1 시간 동안 블로킹합니다*.
1 차 항체를 5% 소 혈청 알부민 (BSA) 에 추가하고, 4°C 에서 인큐베이터에서 흔들며 밤새도록 인큐베이션합니다 [그림 9].
멤브레인을 TBST 로 5 분 동안 세척합니다. 이를 3 번 반복합니다. (팁: 모든 세척 및 항체 인큐베이션 단계는 균일한 교반을 보장하기 위해 실온에서 흔들기에 수행되어야 함).
TBST 에 포함된 5% 우유로 2 차 항체를 추가하고 1 시간 동안 인큐베이션합니다.
멤브레인을 TBST 로 5 분 동안 세척합니다. 이를 3 번 반복합니다
ECL 혼합물을 준비합니다 (제조사가 제공하는 용액 A 와 B 의 비율을 따름). 멤브레인을 1–2 분 동안 인큐베이션합니다 [그림 10]. (팁: ECL 이 멤브레인의 상단과 하단을 모두 덮도록 하기 위해 1000 μL 피펫트를 사용하세요).
어두운 방에서 결과를 시각화합니다 [그림 11]. (팁: 배경이 너무 강하다면 노출 시간을 줄이세요).
레시피
다음 성분을 증류수 H2O 800 ml 에 녹입니다.
NaCl 8.8 g
KCl 0.2g
Tris base 3g
Tween-20 500ul 추가합니다.
pH 를 7.4 로 조정합니다.
증류수 H2O 를 1L 까지 추가합니다.
여과 또는 autoclaving 으로 멸균합니다.
이론
샘플 준비
세포 추출물은 웨스턴 블로팅에 가장 일반적으로 사용되는 샘플 형태입니다. 단백질 추출은 세포 소질 (cytosol) 에 있는 모든 단백질을 수집하려는 시도입니다. 이는 단백질의 변성을 방지하기 위해 저온에서 프로테아제 억제제를 사용하여 수행해야 합니다. 조직 샘플은 더 높은 수준의 구조를 나타내므로, 균질화나 초음파와 같은 기계적 개입이 필요합니다.
단백질을 추출한 후, 추출물의 농도에 대한 좋은 아이디어를 가지는 것이 매우 중요합니다. 이는 궁극적으로 연구자가 샘플들을 동등한 기준으로 비교할 수 있게 합니다. 단백질 농도는 종종 분광광도계를 사용하여 측정합니다. 이 농도를 사용하면 각 웰로 로드되는 단백질의 질량을 농도, 질량 및 부피 간의 관계를 통해 측정할 수 있습니다.
샘플의 적절한 부량을 결정한 후, 글리세롤이 포함된 로딩 버퍼에 희석합니다. 이렇게 하면 샘플이 겔의 웰로 쉽게 가라앉도록 합니다. 추적 염색제 (브롬오피놀 블루) 도 버퍼에 포함되어 있어 연구자가 분리가 얼마나 진행되었는지 볼 수 있게 합니다. 샘플을 로딩 버퍼에 희석한 후 가열하여 고차원 구조를 변성시키되, 황화물 다리를 유지합니다. 고차원 구조의 변성은 아미노산의 음전하가 중화되지 않게 하여 단백질이 전기장 (전달 시 적용됨) 에서 이동할 수 있게 합니다.
샘플의 적절한 부량을 결정하는 것도 매우 중요합니다. 이를 위해 양성 및 음성 통제를 가져야 합니다. 양성 통제는 정화된 단백질이나 통제 추출물과 같은 알려진 표적 단백질원을 사용합니다. 이는 단백질의 동일성과 항체의 활성을 확인하는 데 도움이 됩니다. 음성 통제로는 β-actin 과 같은 널 세포주를 사용하여 염색이 비특이적이지 않은지 확인합니다.
젤 전기영동
웨스턴 블로팅은 스택킹 겔과 분리 겔이라는 두 가지不同类型的 아가로스 겔을 사용합니다. 더 높은 스택킹 겔은 약산성 (pH 6.8) 이며, 낮은 아크릴아마이드 농도로 다공성 젤을 형성하여 단백질을 잘 분리하지 못하지만 얇고 선명하게 정의된 밴드를 만듭니다. 아래쪽 겔인 분리 겔 또는 분해 겔은 기본성 (pH 8.8) 이며, 더 높은 폴리크릴아마이드 함량을 가져서 겔의 구멍을 좁게 만듭니다. 단백질은 크기에 따라 더 잘 분리되는데, 작은 단백질이 더 쉽게 이동하므로 큰 단백질보다 빠릅니다.
겔에 로드된 단백질은 가열로 인해 변성되어 음전하를 띠므로 전압이 가해질 때 양극으로 이동합니다. 겔은 일반적으로 프로토콜 섹션에 설명된 용액을 사용하여 두 개 유리 판이나 플라스틱 판 사이에 부어서 만듭니다. 샘플과 마커는 웰에 로드되고, 빈 웰에는 샘플 버퍼가 로드됩니다. 그런 후 겔을 전원 공급 장치에 연결하여 실행합니다. 전압은 매우 중요하며, 고전압은 밴드를 과열 및 왜곡시킬 수 있습니다.
블로팅
단백질 혼합물을 분리한 후 멤브레인으로 전달합니다. 전달은 겔 표면에 수직인 전기장을 사용하여 단백질을 겔에서移出하여 멤브레인에 이동시킵니다. 샌드위치 형태의 겔 표면과 양극 사이에 멤브레인을 배치합니다. 이 샌드위치는 각 끝에 섬유 패드 (스펀지) 를 포함하고, 젤과 블로팅 멤브레인을 보호하기 위해 필터 종이를 사용합니다 [그림 12]. 여기에서 두 가지 것이 매우 중요합니다: (1) 젤과 멤브레인의 밀접한 접촉으로 명확한 이미지를 보장하고 (2) 겔과 양극 사이에 멤브레인을 배치하는 것. 멤브레인은 그렇게 배치되어야 음전하를 띠는 단백질이 겔에서 멤브레인으로 이동할 수 있습니다. 이 유형의 전달은 전기영동적 전달이라고 불리며, 반건조 조건이나 습식 조건으로 수행할 수 있습니다. 습식 조건은 젤을 건조시킬 가능성이 적어 더 신뢰할 수 있으므로 큰 단백질을 위해 선호됩니다.
멤브레인은 이 과정의 필수적인 고체 지지체입니다. 멤브레인은 두 가지 종류가 있습니다: 질산셀룰로오스와 PVDF. 질산셀룰로오스는 단백질에 대한 높은 친화력과 유지 능력을 위해 사용됩니다. 그러나 그것은 취성 (brittle) 이며, 멤브레인을 재사용하거나 보관할 수 없습니다. 이 점에서 PVDF 멤브레인은 더 좋은 기계적 지지와 블로팅을 재probe 및 보관할 수 있게 합니다. 하지만 PVDF 멤브레인에서 배경은 더 높으므로, 세척이 매우 중요합니다.
세척, 블로킹 및 항체 인큐베이션
블로킹은 웨스턴 블로팅에서 매우 중요한 단계이며, 이는 항체가 멤브레인에 비특이적으로 결합하는 것을 방지합니다. 블로킹은 종종 TBST 에 희석된 5% BSA 또는 무지방 건조 우유를 사용하여 배경을 줄입니다.
무지방 건조 우유는 저렴하고 널리 사용되므로 종종 선호됩니다. 그러나 우유 단백질은 모든 검출 표지와 호환되지 않으므로, 적절한 블로킹 용액을 선택하는 데 주의해야 합니다. 예를 들어, BSA 블로킹 용액은 비오틴과 AP 항체 표지 및 인산 단백질 항체에 대해 선호되는데, 우유는 자체적으로 인산 단백질인 카제인과 비오틴을 포함하여 검사 결과를 방해하기 때문입니다. 주된 항체를 BSA 로 인큐베이션하는 것이 종종 좋은 전략이며, 이는 블로팅이 좋은 결과를 주지 않을 때 항체를 재사용할 수 있게 합니다.
항체의 농도는 제조사의 지시사항에 의존합니다. 항체는 PBS 또는 TBST 와 같은 세척 버퍼에 희석할 수 있습니다. 세척은 배경을 최소화하고 결합되지 않은 항체를 제거하는 데 매우 중요합니다. 그러나 멤브레인을 너무 오래 세척하면 신호도 줄일 수 있으므로 주의해야 합니다.
그런 다음 멤브레인은 주로 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP) 와 같은 효소를 사용하여 검출하는 항체로 표시됩니다. 이 신호는 목표 단백질의 위치에 대응하여 필름에 캡처됩니다.
정량화
웨스턴 블로팅으로 생성된 데이터는 일반적으로 반정량적이라고 간주하는 것이 매우 중요합니다. 이는 단백질 수준의 상대적 비교를 제공하지만 절대적인 양의 측정은 제공하지 않기 때문입니다. 그 이유는 두 가지입니다: 첫째, 별도의 란에 있는 샘플 간의 로드 및 전달률에 변동이 있어 더 정확한 비교가 이루어지기 전에 표준화해야 합니다. 둘째, 생성된 신호는 샘플의 농도 범위에서 선형적이지 않습니다. 따라서 생산된 신호가 선형이 아니므로 이를 농도를 모델링하는 데 사용해서는 안 됩니다.
블로킹은 웨스턴 블로팅의 매우 중요한 단계이며, 이는 항체가 멤브레인에 비특이적으로 결합하는 것을 방지합니다. 블로킹은 종종 TBST 에 희석된 5% BSA 또는 무지방 건조 우유를 사용하여 배경을 줄입니다.
무지방 건조 우유는 저렴하고 널리 사용되므로 종종 선호됩니다. 그러나 우유 단백질은 모든 검출 표지와 호환되지 않으므로, 적절한 블로킹 용액을 선택하는 데 주의해야 합니다. 예를 들어, BSA 블로킹 용액은 비오틴과 AP 항체 표지 및 인산 단백질 항체에 대해 선호되는데, 우유는 자체적으로 인산 단백질인 카제인과 비오틴을 포함하여 검사 결과를 방해하기 때문입니다. 주된 항체를 BSA 로 인큐베이션하는 것이 종종 좋은 전략이며, 이는 블로팅이 좋은 결과를 주지 않을 때 항체를 재사용할 수 있게 합니다.
항체의 농도는 제조사의 지시사항에 의존합니다. 항체는 PBS 또는 TBST 와 같은 세척 버퍼에 희석할 수 있습니다. 세척은 배경을 최소화하고 결합되지 않은 항체를 제거하는 데 매우 중요합니다. 그러나 멤브레인을 너무 오래 세척하면 신호도 줄일 수 있으므로 주의해야 합니다.
그런 다음 멤브레인은 주로 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP) 와 같은 효소를 사용하여 검출하는 항체로 표시됩니다. 이 신호는 목표 단백질의 위치에 대응하여 필름에 캡처됩니다.
정량화
웨스턴 블로팅으로 생성된 데이터는 일반적으로 반정량적이라고 간주하는 것이 매우 중요합니다. 이는 단백질 수준의 상대적 비교를 제공하지만 절대적인 양의 측정은 제공하지 않기 때문입니다. 그 이유는 두 가지입니다: 첫째, 별도의 란에 있는 샘플 간의 로드 및 전달률에 변동이 있어 더 정확한 비교가 이루어지기 전에 표준화해야 합니다. 둘째, 생성된 신호는 샘플의 농도 범위에서 선형적이지 않습니다. 따라서 생산된 신호가 선형이 아니므로 이를 농도를 모델링하는 데 사용해서는 안 됩니다.
문제 해결
웨스턴 블로팅의 절차는 간단하지만, 예상치 못한 결과를 초래할 수 있는 많은 문제가 발생할 수 있습니다. 문제는 (1) 비정상적이거나 예상치 못한 밴드, (2) 밴드가 없음, (3) 희미한 밴드 또는 약한 신호, (4) 블롯의 높은 배경, 그리고 (5) 얼룩덜룩하거나 고르지 않은 스폿으로 그룹화할 수 있습니다.
비정상적이거나 예상치 못한 밴드는 프로테아제 분해로 인해 예상되는 위치에서 생성된 밴드에 기인할 수 있습니다. 이 경우 얼음 위를 보관하거나 새로운 샘플을 사용하거나 항체를 변경하는 것이 좋습니다. 단백질이 너무 높은 위치에 있는 것으로 보이면, 사원형 단백질 구조를 깨기 위해 다시 가열하는 것이 도움이 됩니다. 유사하게, 흐릿한 밴드는 전달 중 고전압 또는 공기 거품에 의해 종종 발생합니다. 이 경우 겔을 더 낮은 전압으로 실행하고 전달 샌드wich 를 적절히 준비해야 합니다. 또한 러닝 버퍼를 변경하여 문제도 해결할 수 있습니다. 평평하지 않은 밴드는 저 저항으로 인해 젤을 너무 빠르게 통과하는 결과일 수 있습니다. 이를 고치기 위해 샘플에 부합하도록 겔을 최적화해야 합니다. 마지막으로, 필름상의 흰색 (음성) 밴드는 과도한 단백질이나 항체로 인해 발생합니다.
다른 문제인 밴드가 없음은 항체, 항원 또는 사용된 버퍼와 관련된 많은 이유에서 발생할 수 있습니다. 부적절한 항체 (주나 부) 를 사용하면 밴드를 볼 수 없습니다. 또한 항체의 농도가 적절해야 합니다; 농도가 너무 낮으면 신호가 관찰되지 않을 수 있습니다. 일부 항체는 웨스턴 블로팅에 사용할 수 없음을 기억하는 것이 중요합니다. 다른 이유는 가시적인 밴드가 없다는 것입니다. 이 경우, 샘플이나 다른 요소 (예: 항체) 에 문제가 있는지 확인하기 위해 다른 출처의 항원을 사용할 수 있습니다. 또한, 세척 시간을 길게 하면 신호도 감소할 수 있습니다. 버퍼도 문제의 원인이 될 수 있습니다. 버퍼가 새롭고 오염되지 않았음을 보장해야 합니다. 버퍼에 나트륨 아지드가 있으면 HRP 를 비활성화할 수 있습니다.
유사하게, 약한 신호는 항체나 항원의 낮은 농도로 인해 발생할 수 있습니다. 노출 시간을 늘리는 것도 밴드를 더 명확하게 만들 수 있는 데 도움이 됩니다. 다른 이유는 무지방 건조 우유가 항원을 가릴 수 있습니다. 이 경우 BSA 를 사용하거나 사용한 우유의 양을 줄이세요.
높은 배경은 종종 항체의 높은 농도로 인해 발생하며, 이는 PVDF 멤브레인에 결합할 수 있습니다. 또 다른 문제는 버퍼가 너무 오래되어 발생할 수 있습니다. 세척 시간을 늘리는 것도 배경을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 과도한 노출도 이 문제를 일으킬 수 있습니다. 따라서 최적의 시간을 달성하기 위해 다양한 노출 시간을 확인하는 것이 좋습니다.
얼룩덜룩하고 고르지 않은 스폿은 주로 잘못된 전달로 인해 발생합니다. 겔과 멤브레인 사이에 갇힌 공기 거품이 있으면 필름에서 더 어둡게 나타납니다. 또한 모든 인큐베이션에 흔들기를 사용하는 것이 중요하여, 인큐베이션 중 균일한 교반이 없어야 합니다. 한 번 다시 세척이 매우 중요합니다. 이 문제도 항체가 블로킹 에이전트에 결합하는 데 의해 발생할 수 있습니다; 이 경우 다른 블로킹 에이전트를 시도해야 합니다. 블로킹 에이전트를 여과하면 일부 오염물질을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 이 문제는 2 차 항체의 응집으로 인해 발생하며, 이 경우 2 차 항원을 원심분리하고 여과하여 응집을 제거해야 합니다.
결론
웨스턴 블로팅은 사용자가 단백질 발현을 정량화할 수 있게 해주므로 매우 유용한 기술입니다. 이 논문은 프로토콜, 그 이론 및 일부 문제 해결 기술을 다뤘습니다. 웨스턴 블로팅은 연구자가 비특이적이면서도 강한 신호를 얻으려는 시도를 하는 복잡한 균형으로 볼 수 있습니다.