I. 샘플 라이시스

부착 세포 배양액 준비

1. 세포 배양 접시를 얼음 위에 올려놓고 차가운 PBS 로 세척합니다.
2. PBS 를 제거하고 차가운 라이시스 버퍼를 추가합니다 (10⁷ 세포/100 mm 접기당 1 mL).
3. 냉각된 플라스틱 세포 스크레이퍼를 사용하여 접기에서 부착 세포를 긁어냅니다. 부드럽게 세포 현탁액을 냉각 원심분리 튜브로 옮깁니다. 대안적으로, Trypsin 으로 세포를 소화하고 PBS 로 세척한 후 원심분리 튜브에 라이시스 버퍼로 세포를 재현탁합니다.
4. 4 °C 에서 30 분 동안 지속적으로 흔듭니다.
5. 4 °C 에서 12,000 rpm 으로 5 분 동안 원심분리합니다.
6. 주의해서 원심분리기에서 원심분리 튜브를 제거하고 얼음 위에 둡니다. 상청액을 새로운 냉각된 튜브로 옮깁니다.

현탁 세포 배양액 준비

1. 소량의 라이시스를 단백질 정량용으로 취합니다. 각 세포 라이시의 단백질 농도를 결정합니다.
2. 단백질 로딩량을 결정하고 5X 샘플 버퍼의 1/4 부피를 추가합니다.
3. 샘플 감소를 위해 혼합된 샘플 버퍼를 100 °C 에서 5 분 동안 끓입니다.

II. 샘플 준비

1. 소량의 라이시를 단백질 정량용으로 취합니다. 각 세포 라이시의 단백질 농도를 결정합니다.
2. 단백질 로딩량을 결정하고 5X 샘플 버퍼의 1/4 부피를 추가합니다.
3. 샘플 감소를 위해 혼합된 샘플 버퍼를 100 °C 에서 5 분 동안 끓입니다.

III. 로딩 및 겔 실행

1. 준비된 샘플을 SDS-PAGE 겔 우물 속으로 로드합니다. 세포 라이시나 조직 균질물의 총 단백질 로딩량은 20-30 μg 이고, 정제된 단백질은 10-100 ng 입니다.
2. 겔을 100 V 에서 1-2 시간 동안 실행합니다. 시간과 전압은 최적화할 필요가 있습니다. 우리는 제조업체의 지침을 따르는 것을 권장합니다. 항체 데이터시트에 달리 권장되지 않는 한, 감소 겔을 사용합니다.

단백질 크기에 따른 겔 퍼센티지

그라데이션 겔도 사용할 수 있습니다.

IV. 겔에서 막으로 단백질 전이

막은 질소셀룰로오스 또는 PVDF 일 수 있습니다. PVDF 막은 일반적으로 사용되며, 사용 전에 메탄올로 1 분 동안 활성화하고 전이 버퍼로 헹구어야 합니다. 전이 시간과 전압은 전이 버퍼에 따라 최적화해야 하며, 우리는 제조업체의 지침을 따르는 것을 권장합니다. 단백질 전이는 블록킹 단계 전에 Ponceau S 염색으로 확인할 수 있습니다.

V. 블록킹 및 항체 인큐베이션

1. 막을 1 시간 동안 실온에서 또는 4 °C 에서 전야에 블록킹 버퍼 (5% 스kim 밀크/1% BSA) 로 블록킹합니다.
2. 블록킹 용액을 제거하고 제조업체의 지침에 따라 항체 희석 버퍼로 일차 항체를 희석합니다. 막을 4 °C 에서 전야에 또는 실온에서 2 시간 동안 인큐베이트합니다.
3. TBST 로 막을 세 번 헹구합니다, 각기 5 분씩.
4. 공액 이차 항제를 제조업체의 지침에 따라 항체 희석 버퍼로 희석하고 막을 1 시간 동안 실온에서 인큐베이트합니다.
5. TBST 로 막을 세 번 헹구합니다, 각기 5 분씩.

VI. 검출 (ECL 방법)

1. ECL 작업 용액 준비: A 용액과 B 용액을 동등한 부피로 혼합합니다.
2. 인큐베이션: 막 표면을 균일하게 덮고 어둡게 1 분 동안 실온에서 인큐베이트합니다.
3. 여분의 액체 제거: (막을 말라지지 않도록 합니다).
4. 노출: 암실에서 X 선 필름에 노출합니다 (5 초에서 10 분).

VII. 버퍼 레시피

RIPA 라이시스 버퍼

50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 나트륨 디옥시콜레이트, 0.1% SDS. 사용 전에 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 추가합니다.

전이 버퍼

25 mM Tris-base, 190 mM 글리신, 20% 메탄올 (PVDF 막용), 10% 메탄올 (질소셀룰로오스 막용).

TBST 세척 버퍼

20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20.