이차항체를 선택할 때 다음 사항이 도움이 됩니다:

1. 1차항체의 숙주 종을 확인하세요. 즉, 이차항체가 반응하는 종입니다 (예: 토끼 항MS2 단클론항체의 경우 1차항체의 숙주는 토끼입니다).

2. 이차항체에 적합한 숙주 종을 선택하세요 (예: 염소 항마우스 IgG, 여기서 이차항체의 숙주는 염소입니다).

3. 이차항체의 교차반응성 또는 특이성, 그리고 교차흡수가 되었는지 여부를 고려하세요.
4. 다중표지 응용에 사용될지 여부, 또는 샘플에 내인성 항체가 포함되어 있는지 여부를 고려하세요.
5. 특이성: 1차항체의 클래스 또는 단편에 올바르게 결합하는지 확인하세요.
6. 검출 방법에 따라 적합한 컨쥬게이트를 선택하세요.

이차항체는 1차항체의 종에 대해 생산됩니다. 따라서 1차항체의 숙주 종과 다른 종에서 생산된 이차항체가 필요합니다. 예를 들어, 1차항체가 토끼에서 생산된 경우 토끼 외의 숙주 종에서 생산된 항토끼 이차항체가 필요합니다 (예: 염소, 마우스 등).

권장되는 항체 희석배율/농도 값은 일부는 항체 개발 과정의 실험을 통해 얻은 것이고, 일부는 협력 기관이나 다른 고객의 경험을 기반으로 합니다. 샘플이나 실험 조건의 차이로 특정 실험에서 최적으로 작동하지 않을 수 있습니다. 권장 값이 적절하지 않은 경우 몇 가지 다른 희석배율/농도를 시험해 보세요.

염소 항마우스 IgG (H+L)는 여러 클래스가 존재하며, IgG와 IgM 항체 사이에는 일부 서열 유사성이 있습니다. 따라서 교차흡수되지 않은 염소 항마우스 IgG (H+L)는 마우스 IgM 항체와 일정 수준의 교차반응성을 보일 가능성이 있습니다. IgM 항체와 완전히 교차반응하지 않아야 하는 경우에는 염소 항마우스 IgG1, 염소 항마우스 IgG2a, 염소 항마우스 IgG2b 등의 항체를 선택하실 수 있습니다.

염소 항마우스 IgG (H+L)는 IgG3를 포함한 모든 마우스 IgG 서브클래스에 결합합니다.

이 항체는 랫트 IgG에 대해 교차흡수되지 않았으며, 이 점에 대한 상세한 정보가 없습니다. 다만 해당 항체가 다클론항체라는 점을 고려하면 이 가능성을 배제할 수는 없습니다.

염소 항마우스 IgG (H+L)의 면역원에는 중쇄와 경쇄가 모두 포함되어 있습니다. 경쇄는 카파 또는 람다입니다. 따라서 이 항체는 카파쇄를 가진 1차항체와 반응하지만 카파쇄에 특이적이지는 않습니다.

두 가지 다른 컨쥬게이트로 표지된 항체는 같은 샘플에서 발색염색과 형광염색 모두의 이미징을 가능하게 합니다. 따라서 멀티모달 연구가 가능하며, 이 목적을 위해 특별 표지를 제공해 드릴 수 있습니다.

이차항체는 1차항체에 결합합니다. 따라서 이차항체의 적용 범위는 1차항체와 더 밀접하게 연관되어 있습니다. 1차항체가 특정 면역검사에 사용될 수 있는 경우 이차항체도 보통 사용될 수 있습니다. 결과적으로 최종 적용 범위는 주로 1차항체의 적용 범위, 이차항체의 표지 종류, 그리고 신호 출력 시스템에 의존합니다.

모든 형광색소는 흡수파장의 강한 빛에 노출되면 일정 수준 퇴색하거나 '광퇴색'이 발생합니다. 가능한 해결책은 다음과 같습니다:

1. Fluor 색소 등 더 광안정성이 좋은 색소를 선택하세요.
2. 대비염색과 이미지 영역을 유연하게 조정한 후 표적 염색으로 이동하여 이미징하세요.
3. 레이저 파워를 낮추거나 중성 밀도 필터를 사용하는 등으로 샘플의 노출 시간과 강도를 줄여주세요.
4. 표지된 샘플의 관찰 시간을 가능한 짧게 하고, 이미징하지 않을 때는 셔터를 닫아주세요.
5. 저배율 대물렌즈 등 개구수가 작은 대물렌즈를 사용하세요.

고전적인 ELISA 시스템은 보통 포획항체와 검출항체를 포함하는 샌드위치 분석 형식을 사용합니다. 두 항체 모두 마우스 단클론항체인 경우 HRP 표지 염소 항마우스 IgG가 둘 다에 결합하여 분석을 비특이적으로 만들어 버립니다. 따라서 ELISA 시스템에서는 포획항체의 숙주 종이 마우스여서는 안 되고, 검출항체는 마우스 유래여야 합니다. 더 나아가 검출되는 샘플에 마우스 IgG 또는 유사 분자가 존재해서는 안 됩니다.

다색 면역형광을 위해 다른 형광색소로 컨쥬게이션된 이차항체를 사용하는 것은 가능하지만, 세심한 설계와 고려가 필요합니다:

1. 형광색소 선택: 여기 및 발광 스펙트럼이 가능한 분리되어 있는 형광색소를 선택하세요. 스펙트럼 겹침이 적을수록 크로스토크(채널 누설)의 가능성이 줄어듭니다. 넓게 분리된 발광 피크를 가진 색소 조합을 우선 선택하세요 (예: Fluor488, Fluor555, Fluor647 조합은 매우 고전적인 조합입니다).
2. 장치 호환성: 선택한 형광색소가 실험실의 현미경 또는 이미지 획득 시스템의 레이저 및 필터 세트에 의해 효과적으로 여기되고 검출되는지 확인하세요. 색소를 선택하기 전에 장치 설정 가이드를 참조하세요.
3. 밝기와 발현 수준의 매칭: 가장 밝은 형광색소(예: Fluor647, Cy5)를 낮은 존재량의 표적 단백질에 할당하세요. 더 어두운 형광색소(예: FITC, Cy2)를 높은 존재량의 표적 단백질에 할당하세요. 이는 채널 간 신호 강도를 평형화하는 데 도움이 되며 강한 신호가 약한 신호를 가리는 것을 방지합니다.
4. 이차항체의 특이성과 교차흡수: 이는 비특이적 교차반응성을 방지하기 위해 매우 중요하며 결과의 신뢰성에 직접 영향을 미칩니다. 교차흡수된 이차항체를 선택해야 합니다. 이는 항체가 다른 종의 면역글로불린과 교차반응할 가능성이 있는 항체를 제거하기 위해 정제되었다는 의미입니다. 예를 들어 마우스와 랫트 모두의 1차항체를 사용하는 경우 항마우스 이차항체는 랫트 혈청 단백질에 대해 교차흡수되어야 하며, 반대 경우도 마찬가지입니다. 이를 통해 이차항체가 표적으로 하는 1차항체에만 결합하고 다른 종의 1차항체와 교차반응하지 않는다는 것을 보장할 수 있습니다.
5. 숙주 종: 모든 이차항체는 같은 숙주 종에서 유래해야 합니다 (예: 모두 염소 유래). 이는 이차항체가 서로를 인식하여 결합하는 것을 방지합니다 (예: 항토끼 이차항체가 잘못 항마우스 이차항체와 결합하는 경우), 이로 인해 위양성 결과가 발생하게 됩니다.
6. 실험 설계와 대조군: 적절한 대조군 없이는 다색 실험의 결과를 해석하는 것이 어렵습니다. 단색 대조군은 필수적입니다. 각 실험에서는 1개의 1차/이차항체 쌍만으로 염색된 샘플을 포함시키고, 다른 채널은 이차항체 희석액만 (또는 1차항체 없이) 사용하세요. 이 대조군들은 실제 이미지 획득 조건에서 각 채널의 크로스토크를 확인하기 위해 사용됩니다. 블랭크 대조군: 모든 1차항체를 생략하고 이차항체 혼합물만으로 배양하여 이차항체의 비특이적 결합을 검출하세요. 순차 배양: 다른 종의 1차항체를 먼저 따로 배양한 다음, 대응하는 종 특이적 이차항체를 혼합물로 배양하는 것이 권장됩니다. 이는 모든 1차항체를 섞은 다음 모든 이차항체를 섞는 것과 비교했을 때 교차반응의 위험을 줄여줄 수 있습니다.
7. 항체 농도 최적화(적정): 사용하기 전에 각 항체 쌍을 적정하여 최고의 신호대잡음비를 주는 최적 농도를 찾으세요. 과도하게 높은 항체 농도는 배경 신호와 비특이적 결합을 증가시킵니다.
8. 이미지 획득과 처리: 잘 진행된 실험이라도 부적절한 이미지 획득은 결과를 망칠 수 있습니다. 모든 채널이 동시에 여기되고 획득되는 것을 방지하세요. 획득 순서를 각 채널을 개별적으로(순차적으로) 여기하고 캡처하도록 설정하세요. 이를 통해 획득 중 채널 간 크로스토크를 완전히 제거할 수 있습니다. 스펙트럼 분리: 장치에 이 기능이 있는 경우(예: 일부 공초점 현미경) 매우 겹친 스펙트럼을 가진 형광 신호를 효과적으로 분리할 수 있어 다색 실험의 강력한 도구입니다. 후처리: 작은 크로스토크가 검출된 경우 소프트웨어로 스펙트럼 분리 계산을 할 수 있지만, 가장 좋은 접근법은 실험 설계 단계에서 크로스토크를 방지하는 것입니다.