다음은 2 차 항체를 선택할 때 도움이 되는 고려 사항입니다:

1. 1 차 항체의 숙주 종을 식별합니다. 즉, 2 차 항체가 반응하는 종 (예: 소아기 (Rabbit) anti-MS2 단클론 항체의 경우, 1 차 항체 숙주는 토끼입니다).

2. 적절한 숙주 종의 2 차 항체를 선택합니다 (예: 쥐 IgG 에 대한 염소 항체로, 여기서 2 차 항체 숙주는 염소입니다).

3. 2 차 항체의 교차 반응성 또는 특이성을 고려하고, 이것이 교차 흡착 (cross-adsorbed) 되었는지 확인합니다.
4. 다중 복제 (multiplex labeling) 응용에 사용될지, 아니면 시료 내내 내인성 항체가 포함되어 있는지 고려합니다.
5. 특이성: 1 차 항체의 클래스 또는 조각에 올바르게 결합하는지 보장합니다.
6. 검출 방법에 따라 적절한 접합체 (conjugate) 를 선택합니다.

2 차 항체는 1 차 항체의 종에 대해 생성되었습니다. 따라서,您需要 1 차 항체 숙주 종과 다른 종에서 생성된 2 차 항체를 필요합니다. 예를 들어,如果您的 1 차 항체가 토끼에서 생성되었다면, 염소, 쥐 등 비토끼 숙주 종에서 생성된 anti-rabbit 2 차 항체를 필요로 합니다.

우리의 추천 항체 희석/농도 값 중 일부는 항체 개발 과정 중 실험에서 도출되거나 협력자 및 다른 고객들의 경험에 기반하여 도출되었습니다. 시료나 실험 조건의 차이로 인해 특정 실험에서 최적화되지 않을 수 있습니다. 우리의 권장 사항이 당신에게 작동하지 않는다면, 여러 가지 다른 희석 농도를 테스트해 보시기 바랍니다.

염소 anti-마우스 IgG (H+L) 는 여러 등급으로 제공되며, IgG 와 IgM 항체 사이에 일부 서열 유사성이 있습니다. 따라서 교차 흡착되지 않은 염소 anti-마우스 IgG (H+L) 는 마우스 IgM 항체에 대한 일정 정도의 교차 반응성을 보일 수 있습니다. IgM 항체에 대한 완전한 교차 반응성 부재를 필요로 하는 경우, 염소 anti-마우스 IgG1, 염소 anti-마우스 IgG2a, 염소 anti-마우스 IgG2b 등과 같은 항체를 선택할 수 있습니다.

염소 anti-마우스 IgG (H+L) 은 모든 마우스 IgG 하위 클래스, including IgG3 에 결합합니다.

이 항체는 쥐 IgG 에 대해 교차 흡착되지 않았으며, 이에 대한 광범위한 정보가 없습니다. 그러나 질문된 항체가 다중클론 (polyclonal) 이기 때문에 이 가능성을 배제할 수 없습니다.

염소 anti-마우스 IgG (H+L) 의 면역원에는 중쇄와 경쇄가 모두 포함됩니다. 경쇄는 클라파 또는 람다일 수 있습니다. 따라서 이 항체는 클라파를 운반하는 1 차 항체와 반응하지만, 오직 클라파만을 위한 것은 아닙니다.

두 가지 다른 접합체로 표지된 항체는 동일한 시료에서 크로마제닉 및 형광 이미징을 가능하게 합니다. 따라서 다중 모드 연구가 가능하며, 우리는 이 목적으로 맞춤형 표지를 제공할 수 있습니다.

2 차 항체는 1 차 항체에 결합합니다. 따라서 2 차 항체의 응용 범위는 1 차 항체와 더 밀접하게 관련됩니다. 만약 1 차 항체가 특정 면역분석에서 사용될 수 있다면, 2 차 항체도 일반적으로 사용할 수 있습니다. 결과적으로 최종 응용 범주는 주로 1 차 항체의 응용 범위, 2 차 항체 표지 유형 및 신호 출력 시스템에 의존합니다.

모든 형광염료는 흡수 파장에서의 강한 빛에 노출될 때 일부 정도에서 퇴색하거나 "photobleaching" 을 겪을 수 있습니다. 잠재적 해결책은 다음과 같습니다:

1. 더 광안정적인 염료, 예를 들어 Fluor 염료를 선택합니다.
2. 카운터 스테인 및 필드 오브 뷰를 유연하게 설정한 후, 표적 염료로 이미지 촬영에 전환합니다.
3. 노출 시간과 강도를 줄입니다. 예를 들어 레이저 파워를 낮추거나 중성 밀도 필터를 사용합니다.
4. 표지된 시료의 관찰 시간을 가능한 한 짧게 유지하고, 관찰하지 않을 때는 셔터를 닫습니다.
5. 낮은 수치孔径을 가진 현미경을 사용합니다. 예: 저파워 현미경.

고전적인 ELISA 시스템은 종종 샌드위치 아세이 형식을 사용하며, 캡처 항체와 검출 항체를 포함합니다. 만약 두 항체가 모두 마우스 단클론 항체라면, HRP 표지된 염소 anti-마우스 IgG 는 둘 다 결합하여 분석을 비특이적으로 만듭니다. 따라서 ELISA 시스템에서 캡처 항체의 숙주 종은 마우스가 아니어야 하며, 검출 항체는 마우스 유래여야 합니다. 추가적으로, 검출되는 시료 유형은 마우스 IgG 또는 유사한 분자를 포함하지 않아야 합니다.

다양한 형광염료로 접합된 2 차 항체를 사용하여 다색 면역형광 실험은 가능하지만, 신중한 설계와 고려가 필요합니다:

1. 형광염료 선택: 여기 및 발광 스펙트럼이 최대한 분리된 형광염료를 선택합니다. 덜한 스펙트럼 중첩은 크로스톡 (bleed-through) 가능성을 줄입니다. 광범위하게 간격된 발광 피크를 가진 염료 조합을 선호합니다 (예: Fluor488, Fluor555, 및 Fluor647 조합이 매우 고전적입니다).
2. 기기 호환성: 선택한 형광염료를 실험실 현미경 또는 이미지 시스템의 레이저 및 필터 세트로 효과적으로 여기하고 검출할 수 있는지 보장합니다. 염료 선택 전에 기기 구성 매뉴얼을 참조하십시오.
3. 밝기와 발현량 일치: 가장 밝은 형광염료 (예: Fluor647, Cy5) 를 낮은丰도 표적 단백질에 할당하고, 더 어두운 형광염료 (예: FITC, Cy2) 를 높은丰도 표적 단백질에 할당합니다. 이는 채널 간 신호 강도를 균형을 맞추어 강한 신호가 약한 신호를 가림을 방지합니다.
4. 2 차 항체 특이성과 교차 흡착: 비특이적인 교차 반응성을 피하고 결과 신뢰성에 직접 영향을 미치는 것이 중요합니다. 교차 흡착된 2 차 항체를 선택해야 합니다. 이는 항체가 다른 종의 면역글로불린과 교차 반응할 수 있는 항체를 제거하기 위해 정제되었습니다. 예를 들어, 마우스와 쥐 1 차 항체를 모두 사용하는 경우, anti-마우스 2 차 항체는 쥐 혈장 단백질에 대해 교차 흡착되어야 하며, 반대의 경우도 마찬가지입니다. 이는 2 차 항체가 오직 해당 표적 1 차 항체만 결합하고 다른 종의 1 차 항체와 교차 반응하지 않도록 보장합니다.
5. 숙주 종: 모든 2 차 항체는 동일한 숙주 종에서 유래해야 합니다 (예: 모두 염소 유래). 이는 2 차 항체가 서로 인식하고 결합하는 것을 방지합니다 (예: anti-rabbit 2 차가 우연히 anti-마우스 2 차에 결합하여), 이는 가짜 양성으로 이어질 수 있습니다.
6. 실험 설계 및 컨트롤: 적절한 컨트롤 없이는 다색 실험 결과는 해석하기 어렵습니다. 단일 스테인 컨트롤이 필수적입니다. 각 실험에는 1 차/2 차 항체 쌍 중 하나만 염색된 시료를 포함해야 하며, 다른 채널은 오직 2 차 항체 희석제 (또는 1 차 없음) 만 받습니다. 이 컨트롤들은 실제 이미지 획득 설정 하에서 각 채널의 크로스톡을 확인하는 데 사용됩니다. 빈 컨트롤: 모든 1 차 항체를 생략하고 오직 2 차 항체 혼합물과 함께 인큐베이션하여 2 차 항체의 비특이적 결합을 탐지합니다. 순차 인큐베이션: 다른 종의 1 차 항체를 먼저 별도로 인큐베이션한 후, 해당 종 특이적 2 차 항체를 혼합물로 인큐베이션하는 것이 권장됩니다. 이는 모든 1 차와 이후 모든 2 차를 혼합하는 것보다 교반 반응 위험을 줄일 수 있습니다.
7. 항체 농도 최적화 (Titration): 사용 전에 각 항체 쌍의 최적 농도를 찾기 위해 항상 희석합니다. 과도하게 높은 항체 농도는 배경과 비특이적 결합을 증가시킵니다.
8. 이미지 획득 및 처리: 잘 실행된 실험이라도 부적절한 이미지 획득은 결과를 망칠 수 있습니다. 모든 채널의 동시 여기와 획득을 피하십시오. 획득 순서를 설정하여 각 채널을 순차적으로 여기하고 캡처하십시오. 이는 획득 중 채널 간 크로스톡을 완전히 제거합니다. 스펙트럼 미싱: 기기가 이 기능을 가지고 있다면 (예: 일부 공초점 현미경), 이는 고도로 중첩된 스펙트럼의 형광 신호를 효과적으로 분리할 수 있으며, 다색 실험에 강력한 도구입니다. 후 처리: 만약 소량 크로스톡이 감지되면, 소프트웨어는 때때로 스펙트럼 미싱 계산을 사용할 수 있지만, 가장 좋은 접근법은 실험 설계 단계에서 크로스톡을 피하는 것입니다.