JC-1

1. 재료 및 시약

• JC-1 프로브, 배지, 시약 키트, 초순수
• JC-1 염색 버퍼, PBS 버퍼 등.

2. 장비

• 형광 현미경 (488 nm 여기 광원을 장착하여 530 nm 와 590 nm 형광을 검출할 수 있음), 유세포 분석기 (488 nm 여기 광원 설정, FL-1 채널은 530 nm 녹색 형광 검출, FL-2 채널은 590 nm 적색 형광 검출), 온도 제어 장비 (37 ℃ 인큐베이터), 피펫

3. 세포 준비

세포가 로그 성장 단계에 있음을 확인하여 최적의 막 전위 상태를 달성합니다.

1. JC-1 염색 작업 용액 준비

키트 지시에 따라 DMSO 에 JC-1 프로브를 녹이고 무청 배지로 희석하여 원하는 농도로 만듭니다 (보통 2.5-10 µg/mL).

6 well plate 의 각 웰에는 1 mL의 염색 작업 용액이 필요하며, 세포 현탁액은 500000 에서 1 백만 개 세포당 0.5 mL의 염색 작업 용액을 요구합니다.

JC-1 이 완전히 녹아있고 혼합되었음을 확인하세요.

2. 세포 염색

세포 배지 에 적절량의 JC-1 작업 용액을 넣고 부드럽게 섞으세요.

37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 세포 플레이트를 15-30 분간 인큐베이션합니다 (세포 종류에 따라 조정).

염색 후 냉각된 PBS 로 세포를 2-3 번 세척하여 결합되지 않은 프로브를 제거하세요.

3. 세포 처리

적합성 세포의 경우 트립신으로 약한处理后에 세포 현탁액을 수집합니다.

현탁성 세포의 경우 단계별로 현탁, 인큐베이션, 원심분리 및 세척합니다.

마지막으로 세포를 JC-1 염색 버퍼 에 재현탁하여 검출을 준비합니다.

4. 검출 및 데이터 수집

형광 현미경 검출: 488 nm 여기 파장, 적색 형광 방사 파장 590 nm, 녹색 형광 방사 파장 530 nm 로 세포를 관찰합니다. 정상 세포는 적색 형광을 나타내며, 손상된 세포는 녹색 형광을 나타냅니다.

유세포 분석 검출: 세포 군집의 적록 형광 비율을 측정하고, 적/녹 형광 비율을 계산하여 미토콘드리아 막 전위 변화를 평가합니다.

1. JC-1 의 용해 및 보관:

JC-1 은 저온에서 고체화하므로 사용 전 20-25 ℃ 물욕에서 녹여야 합니다.

염색이 완료된 후 30 분 이내에 검사를 완료하려고 하며, 미사용 염색 용액은 얼음욕에 보관해야 합니다.

2. 조작 조건:

염색 과정 중 37 ℃ 를 유지하여 온도 변화를 피하세요.

세척 시 JC-1 염색 버퍼를 약 4 ℃ 로 유지하여 더 나은 세척 결과를 얻으세요.

3. 실험의 재현성 및 신뢰도:

• 외부 요인 (예: pH 변화 및 온도 변동) 이 세포에 미치는 영향 피하기.

JC-1 염색 버퍼 의 pH 일관성을 보장하세요.

4. 안전 및 보상 조정:

CCC P(미토콘드리아 전자 전달 사슬 억제제) 을 사용할 때 주의해야 합니다.

유세포 분석기로 검출할 때 보상 조정에 주의를 기울이고, 보상 미세구슬 또는 FITC/PE 염색 항체를 사용하여 보정하세요.