Q1: 세포가 과성장되었을 때 어떤 처리 없이 단순히 배지를 변경할 수 있는가요?

A1: 동물 세포 배양에서 플라스크에 세포를 배양할 때 부착성 성장과 접촉 억제의 특성을 보입니다. 세포가 플라스크 표면 전체를 덮을 경우 더 이상 증식하지 않으며, 두 층으로 성장하는 현상이 나타나지 않습니다. 이 시점에서 배양 플라스크와 배지를 교체해야 하며 그렇지 않으면 세포의 증식이 멈춥니다. 암세포는 이러한 속성에 제한되지 않습니다. 암세포는 접촉 억제에 도달한 후에도 무한히 증식할 수 있습니다.

Q2: 세포 배양 배지가 노랗게 변하는 이유는 무엇이며 세포 상태에 영향을 미치나요?

A2: 배지는 세포가 활발히 성장하여 대사를 통해 많은 양의 젖산과_CO2을 생성하여 배지의 pH 값을 변화시키기 때문입니다. 또한 세포는 배지 내 대부분의 영양분을 흡수하고 이차 대사산물이 점진적으로 증가하여 세포의 지속적 성장을 위한 환경을 더욱 부적합하게 만듭니다. 이 경우 신선한 배지를 교체해야 합니다.

Q3: 세포에 대한 새 배지나 혈청을 어떻게 교체할까요?

A3: 가능한 원인:

(1) 혈청은 자연산품이므로 배치 간 변이가 존재합니다! 혈청 브랜드나 배치 번호를 갑자기 변경하면 세포가 적응하지 못하거나 심지어 죽을 수 있습니다. 추천사항: 혈청을 교체하기 전에 먼저 시료를 테스트하세요. 교체를 할 때는 기존과 새 배치의 혈청을 각각 배양매질에 준비하여 일정 비율로 혼합한 후 세포가 적응되면 교체를 완료합니다. 동시에 우수한 배양 결과를 보이는 배치更多关于를 한 번에 구매하여 향후 실험에서 안정적인 세포 배양 조건을 확보하세요.

(2) 세포에 대한 새 배지를 어떻게 교체할까요? 실험실에서 특정 세포형에 대한 최적의 매질이 없다면 먼저 기존 조건에서 일부 세포를 동결보존한 다음 새 배지의 비율을 점차 증가시켜야 합니다. 25%, 50%, 75% 에서 100% 로 증가시키고 3-5 회 전이 후 세포가 적응되도록 합니다.

Q4: 배지 내 글루타민의 역할은 무엇인가요?

A4: 거의 모든 세포는 글루타민에 대한 높은 요구를 가지고 있습니다. 세포는 단백질 합성을 위해 글루타민이 필요합니다. 글루타민이 부족하면 세포 성장이 저하되고 죽습니다. 따라서 다양한 배양매지는 많은 양의 글루타민을 포함합니다. 여기서 중요한 점은 글루타민을 어떻게 사용하는지입니다. 글루타민은 수용액 상태에서 매우 불안정하므로 -20°C 에서 보관하고 사용 전에 매질에 첨가해야 합니다. 글루타민이 포함된 매질이 4°C 냉장고에서 2 주 이상 보관될 경우 원래의 양만큼 다시 보충해야 합니다. 올바르게 사용하면 추가 보충은 일반적으로 필요하지 않습니다. 예를 들어: 4°C 에서 빛 차폐하여 보관하고, 분할 포장하며, 반복적으로 가열하지 마세요.

Q5:세포 배양에서 배지의 색상 변화는 무엇을 나타내는가?

A5:배지의 색상은 주로 페놀 레드에서 나오며 이는 pH 범위가 6-8 인 매우 민감한 색상 지표입니다. 노란색에서 보라색으로 변합니다. 배양 관찰을 위해 편리하게 하기 위해 페놀 레드是我们에게 배지 상태를 직관적으로 느끼게 해줍니다. 매질이 산성일 경우 더 노랗게, 염기성일 경우 보라색으로 나타납니다. 일반적으로 세균 오염이나 장기간 배지 변경 없이 있을 때 매지는 노란색으로 변하며, 이는 주로 세균과 세포 과성장에 의해 산성 물질이 생성되기 때문입니다. 4°C 냉장고에서 opened 매질을 보관할 경우 매질 내 이산화탄소가 서서히 방출되어 pH 가 더 염기성으로 변하므로 매질이 보라색으로 나타납니다.

보라색 매질에 대해서는 무균 여과한 이산화탄소를 주입하여 pH 값을 조정 후 계속 사용할 수 있습니다. 오랫동안 사용하지 않은 염기성 매질을 계속 사용하는 것은 권장되지 않으며 이는 세포 성장 정지나 사망을 초래할 수 있습니다.

실험실 세포 배양에서 매질의 pH 값은 실험 결과에 큰 영향을 미칩니다. 매질의 pH 값은 직접적이거나 간접적으로 영양분 흡수, 호흡 대사, 폴리아민 대사, DNA 합성, 식물 호르몬의 세포 내외 이동에 영향을 미쳐 형질체 형성 및 형태발생에 영향을 줍니다. pH 값이 6.5 보다 클 경우 고온고압 멸균 과정에서 색상 반응이 일어납니다. pH 값이 6.8 일 때 색상에 질적 변화가 있습니다. 일반적으로 멸균 시간과 압력은 매질의 색상을 변화시키지 않습니다.

Q6: 세포 배양에서 주의해야 할 문제점은 무엇인가요?

(1) 세포 배양매질에 NaHCO3 을 반드시 첨가해야 하며 이는 용액의 pH 를 안정화시키는 역할을 합니다.

(2) 배지 색상 변화를 배지 교체의 지표로 사용하는 것은 충분하지 않지만 매우 실용적입니다. 배양매질에 존재하는 지표 페놀 레드의 변화는 액체 색상의 변화를 통해 간접적으로 세포 성장 상태를 나타냅니다. 세포가 활발히 성장하여 산을 생성하면 액체는 노란색으로, 반대로 보라색-붉은색으로 나타납니다.

(3) 세포를 관찰할 때 액체의 큰 pH 변화는 세포에 해를 끼치고 세포 성장에 불리합니다.

Q7: 대부분의 세포 배양에 왜 5% CO2 를 사용하는가?

A7: 세포 배양에 사용되는 인큐베이터는 일반적으로 CO2 인큐베이터라고 하며 기체 환경은 95% 공기와 5% CO2 입니다. CO2 는 세포의 대사 생성물이자 세포가 필요한 성분입니다. 이는 주로 배지 pH 를 유지하는 것과 직접 관련이 있습니다. 대부분의 동물세포는 pH 7.2-7.4 의 약간 염기성 환경을 필요로 하며, 가능한 한 6.8-7.6 을 초과하지 않아야 합니다. 세포 배양 과정에서 CO2 방출량이 증가하면 매질이 산성으로 변하므로 NaHCO3 이 종종 첨가됩니다 (물이 녹은 CO2 로 형성된 H2CO3 과 버퍼 쌍을 이루어 pH 를 조정)합니다. NaHCO3 은 CO2 를 방출하려는 경향이 있으며, CO2 를 첨가하면 이 반응을 억제할 수 있습니다. 인큐베이터 내 CO2 농도는 매질 내 NaHCO3 농도와 균형을 이루어야 합니다. 인큐베이터 내 CO2 농도가 너무 높으면 pH 가 감소하고, 너무 낮으면 pH 가 증가합니다.

Q8: 모든 세포 배양매질이 동일한 CO2 농도를 요구하는가?

A8: 아닙니다. CO2 농도는 NaHCO3 농도에 의존합니다. 용액 내 CO2 와 -HCO3 은 pH 를 약알칼리성 수준 (약 7) 에 유지하는 버퍼 시스템을 형성합니다. 이는 또한 포유류 세포 성장에 대한 최적의 pH 입니다. 매질이 오랫동안 공기에 노출되면 -HCO3 이 빠르게 분해되어 pH 가 급격히 증가하며 시각적으로 빨강에서 보라색으로 변합니다. 매질을 세포 배양 인큐베이터로 다시 놓으면 CO2 의 영향하에 서서히 보라색에서 다시 빨간색으로 변화합니다.

다른 세포 배양매지는 다른 NaHCO3 농도를 가지므로 다른 세포 배양매지는 해당되는 CO2 농도를 선택해야 합니다:

NaHCO3 (g/L) 농도가 <1.5, 필요한 CO2 농도는 4%;

NaHCO3 (g/L) 농도가 1.5-2.2 사이일 때, 필요한 CO2 농도는 5%;

NaHCO3 (g/L) 농도가 2.2-3.4 사이일 때, 필요한 CO2 농도는 7%;

NaHCO3 (g/L) >3.5, 필요한 CO2 농도는 10%.

Q9: 세포가 계속 성장함에 따라 pH 값이 점차 감소하며 (젖산의 대사 축적으로 인해) 매지는 노란색으로 변합니다. 배양 과정에서 배지의 pH 가 비정상적으로 변화한다고 발견할 때 우리는 무엇을 해야 하나요?

A9: 처리 방법

(1) CO2 농도가 적절한지 확인하세요: 매질 내 탄산나트륨 농도에 따라 인큐베이터의 CO2 백분율을 조정하세요. 탄산나트륨 농도가 2.0 에서 3.7 g/L 일 경우 각각 5-10% CO2 를 사용하세요. 또는 CO2 비의존성 매질로 전환하세요.

(2) 배양 플라스크 뚜껑이 너무 조여 있는지 확인하세요: 1/4 돌리기를 풀어주세요.

(3) 탄산염 완충이 부족한지 확인하세요: HEPES 버퍼를 최종 농도 10-25 mM 으로 첨가하세요.

(4) 매질에 잘못된 염이 포함되어 있는지 확인하세요: CO2 조건 하에서 Earle's 염 매질을 사용하고 대기 조건 하에서 Hanks' 염 매질을 사용하세요.

(5) 세균, 효모 또는 곰팡이 오염을 확인하세요: 배양과 매지를 폐기하고 가능하면 탈오염 작업을 시도하세요.

(6) 매질과 다른 시약의 사용 전후에 75% 에탄올로 외부 표면을 소독하세요. 또한 시약 병 개구를 너무 오래 노출하지 마세요;

(7) 매질과 다른 시약을 가능한 한 많이 분할 포장하세요. 오류가 발생하면 다시 사용하는 것이 가장 좋습니다;

매질을 다룰时无菌 일회용 플라스틱 또는 유리 피펫을 사용하세요. 각 피펫은 한 번만 사용하여 교차 오염을 피하세요;

다른 사람과 매질 및 다른 시약을 공유하지 마세요;

한 번에 하나의 세포줄만 다룰 때 교세포 간 교차 오염을 피하세요.

Q10: DMEM 매지가 왜 밝은 빨간색인가요?

A10: 매지의 색상은 주로 페놀 레드에 의해 표시되며 이는 pH 범위가 6-8 인 매우 민감한 색상 지표입니다. 페놀 레드는 필수적이지 않으며 경우에 따라 중복될 수도 있습니다. 페놀 레드는 스테로이드 호르몬과 유사한 효과가 있으므로 세포 배양이 스테로이드 호르몬 관련 연구를 포함할 경우 추가하지 않는 것이 좋습니다. 그러나 배양 관찰을 위해 편리하게 하기 위해 페놀 레드是我们에게 배지 상태를 직관적으로 느끼게 해줍니다. 매질이 산성으로 변하면 노란색, 염기성으로 변하면 보라색으로 나타납니다.

Q11: CO2 가 없는 인큐베이터에 배양접시를 놓았을 때 매지가 왜 보라색으로 변하는가?

A11: 일반적인 DMEM 에서 사용되는 버퍼 시스템은 NaHCO3 이며 반응식은 다음과 같습니다. 2NaHCO3=Na2CO3+CO2+H2O. CO2 가 없는 인큐베이터에서 매질 내 CO2 가 지속적으로 방출되어 탄산이 감소하고 용액은 염기성으로 변하여 보라색으로 됩니다. 유사하게, 오랫동안 개봉된 DMEM 병의 매지도 같은 이유로 서서히 보라색으로 변합니다.

Q12: 보라색 매질도 사용할 수 있나요?

A12: 보라색 매질을 뚜껑을 풀어서 CO2 인큐베이터에 놓으세요. некоторое 시간 후 색상이 밝은 빨간색으로 변한 다음 계속 사용할 수 있습니다. 그러나 너무 오랫동안 사용하지 않았고 색상 변화를 겪은 매지는 공기 중 산화 후 매질 성분이 변화했을 가능성이 있으므로 사용해서는 안 됩니다. 세포 배양 과정에서 매질의 색상과 투명도 변화를 확인하세요. 노란색은 pH 감소, 붉거나 보라-붉은색은 pH 증가, 세포 성장 정지 또는 사망을 나타냅니다. 일반적으로 안정적으로 성장하는 세포는 2-3 일마다 매지를 교체해야 하며, 천천히 성장하는 세포는 3-4 일마다 매지를 교체할 수 있습니다.

Q13: 매질 오염을 어떻게 예방할까요?

A13: 해결책

(1) 사용 전후에 75% 에탄올로 매질 및 다른 시약 병의 외부 표면을 소독하세요. 또한 시약 병 개구를 너무 오래 노출하지 마세요;

(2) 매질 및 다른 필요한 시약을 가능한 한 많이 분할 포장하세요. 작업 중 오류가 발생하면 다시 사용하는 것이 가장 좋습니다;

(3) 매질을 다룰时无菌 일회용 플라스틱 또는 유리 피펫을 사용하세요. 각 피펫은 한 번만 사용하여 교차 오염을 피하세요;

현미경으로 매일 세포를 관찰하고 매질의 탁도를 주의 깊게 확인하세요;

(5) 매질 및 다른 시약을 다른 사람과 공유하지 마세요;

한 세포줄당 하나의 매질 병을 사용하세요. 이는 교차 오염을 효과적으로 피할 수 있습니다;

한 번에 하나의 세포줄만 다룰 때 교세포 간 교차 오염을 피하세요.