Q1:세포 오염 여부를 확인하는 방법은?
A1: 단계 1: 육안으로 관찰;
배지가 노랗게 변하거나 액체가 탁해졌나요?
단계 2: 현미경으로 관찰 (200X, 400X);
배지 내 브라운 운동이 아닌 빠르게 움직이는 입자가 있나요? 세포 사이와 배양 매체 사이에 모래 같은 물질이 덮여 있나요? 배양 접시에서 '작은 버섯' 모양의 생물이 자라나요? 세포 상태가 변했나요?
Q2:세포 오염의 유형은 무엇인가요?
A2:(1) 세균 오염: 세균에 감염된 세포의 경우 매질이 현저히 노랗게 변하고 탁해집니다. 현미경에서 구형 또는 막대형 세균이 매질 내에서 빠르게且不규칙하게 움직이는 것을 볼 수 있습니다. 세균은 규칙적인 형태와 균일한 분포를 보입니다. 세균 오염 후 세포 내 과립이 증가하고 굵어지며, 결국 세포가 둥글게 변해 떨어지고 죽습니다;
(2) 곰팡이/버섯 오염: 곰팡이 감염 세포의 경우 매질 색상은 보통 변하지 않으며 초기 오염 단계에서는 감지하기 어렵습니다. 현미경에서 곰팡이 균사체를 볼 수 있습니다. 곰팡이/버섯 오염 발생 2-3 일 후, 매질에 눈에 보이는 하얗거나 노란색 곰팡이 군집이 형성되고 현미경으로 군집 구조를 관찰할 수 있습니다. 곰팡이 오염 후 세포 성장이 느려지며, 결국 영양소 고갈과 독성 영향으로 인해 세포가 떨어지고 죽습니다;
(3) 마이코플라즈마 오염: 육안이나 현미경으로 직접 관찰할 수 없습니다. 마이코플라즈마 감염 세포는 상태가 현저히 악화되고 성장이 느려지며 세포 잔해가 증가합니다. 검증에는 PCR, 일회성 색도법 또는 형광 염색을 사용할 수 있습니다;
Q3:세포 오염이 발견되면 어떻게 해야 하나요?
A3:(1) 세균 오염의 경우, 초기에 발견되어 세포 상태가 영향을 받지 않은 경우 10% 항생제로 세척하거나 젤린산 50U/mL, 테트라사이클린 10μg/mL 또는 기타 항생제를 사용하세요. 세포 상태가 이미 매우 좋지 않은 경우에는 직접 폐기하고 새로운 세포를 재배양하는 것이 좋습니다;
(2) 곰팡이 오염의 경우 제거하기 어렵므로 직접 폐기하는 것이 좋습니다;
(3) 마이코플라즈마 오염의 경우 50μg/mL 마이코플라즈마 제거제를 추가하고 최소 2 주 동안 처리합니다;
Q4:세포 오염을 피하는 방법은?
A4:I. 환경 요건
(1) 세포 배양실의 청결한 공기를 유지합니다;
(2) 층류 캐비넷과 생물안전장구를 적절히 배치하여 상호 간섭을 피합니다;
(3) UV 빛으로 세포 배양실을 정기적으로 조사하고 오존으로 소독합니다. 인큐베이터를 정기적으로 청소합니다. 세포 배양실 바닥에 84 소독약으로 빗자루질합니다;
(4) 사용 전 층류 캐비넷에 UV 빛으로 30 분간 조사하고 사용 후 75% 알코올로 닦습니다;
(5) 세포 배양실 전용 멸균 실험복을 입고 장갑과 마스크를 착용하며 세포 배양실에 들어갈 때 전용 신발을 갈아입습니다;
II. 실험 조작 요건
(1) 인큐베이터에서 세포를 꺼내거나 넣기 전에 손에 알코올을 소독합니다. 문 개방 시간과 빈도를 최소화합니다;
(2) 조작 중 시약이 사용되지 않을 때는 즉시 덮개를 닫고 작업 영역 주변으로 이동합니다. 열린 용기를 지나가지 않도록 주의합니다;
(3) 피펫을 사용할 때는 배액이 더 쉽게 흡인되도록 용기를 기울입니다. 시약 팁으로 병 입구나 내벽을 만지지 마십시오. 흡인할 경우 잔류 액체로 인한 세균 성장을 방지하기 위해 즉시 알코올 면봉으로 닦습니다;
(4) 폐기물을 폐기통에 버릴 때는 피펫 팁과 본체에 튀김으로 오염되는 것을 피하기 위해 부드럽게 처리합니다. 실험 후 즉시 폐기물을 버리고 용기를 헹구한 후 알코올로 뿌려 층류 캐비넷에서 UV 소독을 진행합니다;
Q5: 세균 오염을 어떻게 처리해야 하나요?
A5: 치료 방법
(1) 세균에 감염된 세포의 경우 매질이 현저히 탁해지고 침착 후 하단에 모래 같은 침전물을 형성합니다. 현미경에서 세균이 세포 주위에 둘러싸여 있는 것을 볼 수 있습니다.
(2) 세균 오염 검출을 위해 세포 배양 상층액 약 1ml 를 채취하여 3ml LB 매질에 접종한 후 진탕하면서 밤새 배양합니다. 매질이 현저히 탁해지면 세균 오염을 확인합니다. 뚜렷한 색상 변화가 없으면 오염이 없다는 것을 의미합니다.
(3) 치료 후 오염된 세포를 즉시 폐기하여 다른 세포에 영향을 미치지 않도록 합니다.
(4) 세포 잔해는 세균 및 곰팡이 오염과 구별되어야 합니다. 주요 차이점은 세포 잔해가 현저히 증식하지 않는 반면, 세균과 곰팡이는 밤새 배양 후 명확하게 증식할 수 있으며 심지어 세포를 완전히 덮을 수도 있다는 점입니다.
(5) 세균 오염은 대개 오염물질이 유입된 후 1-2 일 이내에 발생하므로 오염을 발견할 때 소스를 추적하여 확인할 수 있습니다.
Q6: 곰팡이 오염을 어떻게 처리해야 하나요?
A6: 치료 방법
(1) 곰팡이에 감염된 세포의 경우 분지형 곰팡이 균사체 또는 기타 형태의 곰팡이를 현미경으로 명확하게 볼 수 있습니다. 눈에 보이는 매질 내에 뚜렷한 하얀 점이나 입자 물질이 떠 있는 것을 볼 수 있습니다.
(2) 곰팡이는 검사가 필요 없으며 현미경과 육안으로 구별할 수 있습니다.
(3) 치료 후 곰팡이 오염된 세포를 즉시 폐기합니다. 인큐베이터와 작업대를 소독하여 다른 세포에 오염되는 것을 방지합니다.
(4) 곰팡이 오염은 대개 오염물질이 유입된 후 2-4 일 이내에 발생합니다. 오염을 발견할 때 소스를 추적하여 확인할 수 있습니다.
Q7: 마이코플라즈마 오염을 어떻게 처리해야 하나요?
A7: 치료 방법
(1) 마이코플라즈마 오염은 중국에서 흔한 문제입니다. 대부분의 실험실은 마이코플라즈마 검출 및 제어 방법을 갖추지 못하여 많은 비율의 세포가 마이코플라즈마에 감염됩니다.
(2) 마이코플라즈마 검출 방법에는 여러 가지가 있으며 PCR, 형광법, 배양법 및 키트를 포함합니다. 서로 다른 방법은 민감도, 특이성 및 대상 마이코플라즈마 유형이 다르므로 검출 결과가 다를 수 있습니다. 즉, 동일한 샘플에 대해 일부 방법은 양성으로 검출하고 일부는 음성이며, 일부는 강하게 나타나고 일부는 약하게 나타납니다.
(3) 마이코플라즈마 치료에는 6 우물 플레이트에서 배양하고 매질을 일일히更换하며, 세포가 중첩될 때 일부 세포를 분리하여 폐기합니다. 이를 통해 기본적으로 2-3 주 내에 완전한 제거를 보장할 수 있습니다.